Analýza polymorfismu délky restrikčních fragmentů

Široké použití různých restrikčních endonukleáz pro analýzu chromozomální DNA odhalilo obrovskou variabilitu lidského genomu. I malé změny v kódovacích a regulačních oblastech strukturních genů mohou vést k ukončení syntézy určitého proteinu nebo ke ztrátě jeho funkce v lidském těle, což obvykle ovlivňuje fenotyp pacienta. Přesto přibližně 90% lidského genomu sestává z nekódujících sekvencí, které jsou více variabilní a obsahují mnoho takzvaných neutrálních mutací nebo polymorfismů a nemají fenotypový výraz. Taková polymorfní místa (lokusy) se používají při diagnostice dědičných onemocnění jako genetických markerů. Polymorfní lokusy jsou přítomny ve všech chromozomech a jsou spojeny se specifickou oblastí genu. Po určení lokalizace polymorfního lokusu je možné zjistit, s jakým genomem je spojena mutace, která způsobila onemocnění u pacienta.

Pro izolaci polymorfních oblastí DNA se používají bakteriální enzymy - restrikční enzymy, jejichž produktem jsou restrikční místa. Spontánní mutace, které se vyskytují v polymorfních místech, je činí odolnými nebo naopak citlivými na působení specifického restrikčního enzymu.

Mutační variabilita restrikčních míst může být detekována změnou délky omezených fragmentů DNA, jejich separací pomocí elektroforézy a následné hybridizace se specifickými DNA sondami. Při nepřítomnosti omezení v polymorfním místě se na elektroforegrech detekuje jeden velký fragment a pokud je přítomen, bude přítomen menší fragment. Přítomnost nebo nepřítomnost restrikčního místa v identických místech homologních chromozomů umožňuje spolehlivě označit mutantní a normální gen a sledovat jeho přenos na potomstvo. Takže ve studii DNA pacientů, u obou chromozomů, jejichž restrikční místo je přítomno v polymorfní oblasti, budou na elektroforem odhaleny krátké fragmenty DNA. U pacientů homozygotních pro mutaci, která modifikuje polymorfní restrikční místo, budou detekovány fragmenty s větší délkou a v heterozygotních fragmentech budou identifikovány krátké a dlouhé fragmenty.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9]