Embryonální kmenové buňky

Objev embryonálních kmenových buněk - tam nebyla žádná náhoda, a objevil se na připravované průzkumu půdy v oblasti vývojové biologie výzkumu. Výraz „kmenová buňka“ se zavádí do medicíny v roce 1908 na hematologické společnosti kongresu v Berlíně, Alexander Maximov aplikován na hemopoetických buňkách. Dlouho před izolaci a přípravu stabilních linií pluripotentních embryonálních kmenových buněk v časném vývoji výzkumného procesu použít dřík terato- (embryo-karcinomové buňky, se kterou studoval neznámé mechanismy embryogeneze, zahrnující sekvenci exprese časných genů a proteinových produktů jejich práce.

Ale je totipotenciál lidského genomu nenahraditelně ztracen v procesu evoluce? Ne, a embryogeneze je důkazem. Pokud tomu tak je, pak, kdy bude v zásadě realizována druhá cesta evolučního vývoje? Pravděpodobně, když člověk opustí vesmír, kde jsou podmínky prostředí poměrně dlouhé. Ztráta kostní hmoty (kostní demineralizace v beztížném stavu) velmi pomalu přístupnější remodelaci a regeneraci může být považován za první krok k lidskému adaptačního procesu jako druhu existence v prostoru. Platba za druhou cestu evolučního vývoje se však bude lišit - sterilita bude cenou, která se vrátí všem buňkám všelijakosti a absolutní plasticity. Takže množit se v tomto světě "evolučních chameleonů" nebude mít meiózu, otpochkovaniem. Ale budeme žít dlouho. Telomerasova nesmrtelnost je nesmrtelnost améby. V mnohobuněném organismu jsou kmenové buňky substrátem kvantitativní a kvalitativní dlouhověkosti.

[1], [2], [3], [4], [5], [6]

Zdroje embryonálních kmenových buněk

Dnes zdroje embryonálních kmenových buněk pro laboratorní testy linie myší s teratokarcinomem (129 / SV, F19, F8, Zin 40, CGR 86, R, CCE, JM-1, E14Tg2a, CGRSb) a lidského teratokarcinomu (NTERA-2, Tera-2 , H-9 klon), stejně jako Hess Trauneona. Nicméně, přítomnost podrobně buněčnou pas ukazuje imunitní fenotyp, výsledky analýzy chromozomu exprese profilu mRNA vystavených receptory a protein intracelulární signalizace nekompenzuje významné nevýhody teratokartsinomnyh linky HSV - rychlé ztrátě totipotencí a nemožnost použití v klinických studiích, a smíšené diferenciaci v kultuře, je velmi obtížné izolovat čistou specializovanou linií z heterogenní populace buněk. Z tohoto důvodu, obvykle zdroj ESC linky vyráběny pro lékařské účely, slouží jako vnitřní buněčné masy blastocysty, embrya jednotlivé blastomery z 8-buněčné fázi vývoje, buňky morula pozdější stádia a primární zárodečné buňky.

Je třeba poznamenat, že teratokarcinomové buňky, i když mají vlastnost pluripotence, mají ve srovnání s ESC významně nižší potenciál pro pluripotentní použití. Jejich integrace s embryonálními buňkami zřídka vede k tvorbě chimér, u kterých se navíc nikdy nevytváří gamety s genotypem buněk teratokarcinomu. Předpokládá se, že to je kvůli častému výskytu v průběhu kultivace buněk teratokarcinom chromozomálních abnormalit: ztráta chromozomu Y, trisomie odrůdy, delece nebo translokace.

Pokusy rozlišovat lidskou linii ESC byly provedeny mnohokrát, ale tento úkol nebylo možné vyřešit, protože normální lidské blastocysty jsou obtížně přístupné k objektům. Kromě toho u lidí je četnost chromozomálních abnormalit vyšší než u embryogeneze zvířat. Převážná většina raných lidských embryí získaných po fertilizaci in vitro vykazuje chaotický chromozomální mozaicismus a často existují numerické a strukturální odchylky. Dokonce později ve stádiu blastocysty tvoří pouze 20-25% lidských embryí buňky s normálním karyotypem. Bylo téměř nemožné použít takové embrya k vytvoření ESC, jelikož zygoty byly obvykle kultivovány na stupně dvou nebo čtyř blastomer a poté transplantovány do dělohy. Pouze relativně nedávno byla spolehlivá technika vyvinutá pro kultivaci oplodněných lidských vajíček do fáze blastocysty. Zavedení této techniky do praxe in vitro fertilizace nejen zvýšilo četnost úspěšného výsledku implantace, ale také učinilo normální blastocysty dostupnější objekt.

Dalším zdrojem pluripotentních kmenových buněk je primární pohlavní buňky, které, na rozdíl od vyspělejších populací progenitorových germenativnogo epitel, nejsou na povrchu beta-integrinu, ale exprimují vysoké aktivity shelochnoy fosfatázu. Je třeba poznamenat, že v experimentu populace kmenových buněk, které jsou vytvořeny z primordiálních zárodečných buněk jsou studovány s 80-tých letech minulého století. Současně byla vyvinuta technika izolace primárních zárodečných buněk z rudimentu myší embryonální gonády. První neúspěšné výsledky kultivace primordiální zárodečné buňky in vitro naznačuje marnost těchto snah, jako buňky, i když přežil, ale ne množit a zemřel během prvního dne. Později bylo zjištěno, že primární myší zárodečné buňky proliferují in vitro v přítomnosti pouze v kultivačním médiu rozpustných a na membránu vázané specifické polypeptidových růstových faktorů. Četné studie ukázaly, že je třeba přítomnost v kultivačním médiu nejen LIF, ale membrannosvyazannyh a oceli rozpustný faktor (SIF) pro přežití a proliferaci primordiálních zárodečných buněk. Tyto peptidy jsou produkovány somatických buněk embryí homozygotní pro mutaci z oceli, a jeden z nich je ligand proto-onkogenu cKIT.

Primární zárodečné buňky savců a lidí mají extragonadální původ a jsou zdrojem klonálního vývoje linie pohlavních buněk. Startovní čára primordiální zárodečné buňky, jakož i všechny tkáně z embrya a extraembryonální mezodermu dává epiblastu (primární ektodermu) časných embryí, které mají mozaiky strukturální organizaci. Způsob mikrochirurgické odstranění různých částí instalován brzy embryo lokalizační zóna v epiblastu z spáchal progenitorových klonových primordiální zárodečné buňky. S rodamindekstrana, který byl použit jako buněčný marker se zjistilo, že prekurzory primordiální zárodečné buňky jsou umístěny v proximální oblasti epiblastu, v blízkosti extraembryonální ektodermu. Primární sexuální buněčná linie vyvstává z 45-buněčného klonu, jehož rozdělení se objevuje na samém začátku gastrulace. Potom přichází segregaci klonu, a v procesu gastrulation, primární zárodečné buňky vstoupí do extraembryonální mesodermu a jsou k dispozici na spodní části zárodek z allantois, za z primitivního pruh. Odtamtud primární zárodečné buňky migrují směrem k ventrální endoderm z hindgut a pohybovat okruží i nadále aktivně a usadil se na konci migrace genitálních hřebenech. V procesu migrace, stejně jako v prvních 2-3 dnech lokalizace v rudimentu gonad, primární sexuální buňky aktivně proliferují a podstupují osm replikačních cyklů. Pokud se na začátku migrace, existuje asi 50 primární zárodečné buňky, více než 25 000 v genitálních hřebenech myších embryí dvanácti dnů v počtu primordiálních zárodečných buněk.

Funkční podobnost HSR a primordiálních zárodečných buněk ukazuje úplnou integraci druhé v náhradní blastocysty vnitřní buněčné hmoty a následné úplné vývoj embrya, tkáně, které se skládají pouze z potomků primordiální zárodečné buňky. Podle dalších charakteristik byly rovněž identické myší primární zárodečné buňky PGC, ukazující schopnost diferenciace do různých směrů, pro vytvoření embryoidních tělísek in vitro, A in vivo tvoří teratomy při aplikován subkutánně do imunodeficientních myší připomínajících spontánní teratomů varlat myší linie 129 / ter.

Je zjištěno, že po přidání do LIF média, a rozpustné membrannosvyazannogo SIF izolované primární zárodečné buňky, 8-denní myší embrya přežít a proliferují v kultuře po dobu 4 dnů, ale pak smrti. Kromě toho je doba, kdy kultura smrti pozorovány primordiální zárodečné buňky, se shoduje s fázi vývoje myších embryí (12,5-13,5 dny), když pupeny primární gonadální ženy zárodečné buňky vstoupí meiosis a v samčích primordiálních zárodečných buněk jsou blokovány mitotickým rozdělení. Nicméně, pokud se přidat k životnímu prostředí nejen růstové faktory LIF a SIF, ale i FGF2, jsou primární zárodečné buňky pokračovat proliferirovat a subkultury, kdy se vytvoří kolonie mohou množit i po vyjmutí z prostředí růstových faktorů (SIF a FGF). Takové buňky mohou být dlouho kultivovány na embryonálním fibroblastovém substrátu bez přidání rozpustného růstového faktoru LIF. Tyto stabilní buněčné linie odvozené od primárních zárodečných buněk se nazývají embryonální zárodečné buňky. Tento termín nemůže být považován za úspěšný, jako když kultivované EG-buňky nemohou být získány embryonální zárodečné buňky, které jsou schopny provádět následných fází oogeneze nebo spermatogeneze. To je způsobeno skutečností, že EG-buněčné linie, i když jsou odvozené z primordiálních zárodečných buněk, ale v kultuře získání vlastnosti pluripotentních embryonálních kmenových buněk ztrácejí schopnost spáchání germenativnye linku. Jinými slovy, primární sexuální buňky ztrácejí při kultivaci vlastnosti prekurzorů gamet a jsou přeměněny na pluripotentní buňky typu ESC.

Je třeba poznamenat, že když se podávají imunogenefické EG myši, nevznikají teratomy. Předpokládá se, že ztráta schopnosti lidských EG buněk iniciovat teratomy je způsobena skutečností, že tyto linie nebyly vytvořeny přímo z kultivovaných primárních zárodečných buněk, ale byly získány z buněk izolovaných z embryoidních tělísek. Proto je možné, že jsou potomky pluripotentních, ale již zavázaných buněk.

Je třeba poznamenat, že existují zásadní rozdíly mezi buňkami EG a primárními zárodečnými buňkami. Ty neumožňují získat chimérní myší embrya, což naznačuje nedostatečnou schopnost primárních zárodečných buněk integrovat se do vnitřní buněčné hmoty nebo trophectodermu. Populační charakteristiky primordiální zárodečné buňky podobné většině somatických buněk spáchaných linií pozdějších embryí, jehož zavedení do blastocysty také vede ke vzniku chimérických embryí.

Modifikace metody kultivace embryoidních tělísek získaných s EG-agregací buněk povolených selekcí na selektivních médiích přijímat další populace pluripotentních buněk, nazývány „buňky odvozené z embryoidních tělísek (embryoidních těla odvozených buněk - EBD-buňky). EBD Schopnost buněk proliferovat v kultuře po dlouhou dobu bylo možné vytvořit stabilní buněčné linie potvrzených buňky. Buněčné klony byly získány expresí mRNA a širokou škálu specializovaných buněk markerových proteinů. Tento přístup jako výsledek se ukázalo, že primární pohlavní lidských pluripotentních buněk a diferenciaci in vitro do různých buněčných typů: neurony, glie, vaskulární endotel, hematopoetických buněk, svalů a endodermální buněk.

Alternativní zdroje embryonálních kmenových buněk

Alternativní zdroj lidských linií ESC může být hybridní buňka. Implantaci do dělohy pseudopregnantních kravského geterogenomnoy získané struktury při slučování elektroporací fetusa lidských somatických buněk s vaječných krav, které předtím byly odstraněny z pronukleu, umožňuje přijmout vnitřní buněčné hmoty předem implantaci embrya umělých vývojových stádiích. Za tímto účelem se v prvním stupni se získá z blastocysty vejce krávy s transplantovanými lidskými buňkami jádra.

Druhý stupeň se izoluje z blastocysty embryoblastu, a z ní - ESC metodou Thomson. Je pozoruhodné, že nejlepších výsledků v separačních ESC linií podle tohoto způsobu byly získány za použití jádra folikulárních buněk nebo primordiálních zárodečných buněk, které přetrvávají v lidském těle ve stavu režimu spánku. To je způsobeno skutečností, že vejce krávy transplantované lidské buňky jádro neukorochennye by měl mít vysokou aktivitu a telomer telomeazy, který se vyhýbá předčasné stárnutí ESC klony odvozené z hybridního vejce (Repin, 2001). Je známo, že nejdůležitější intracelulární signální proteiny PGC jsou OCT3, Oct4, Tcf, Groucho, které patří do tzv tlumiče, chromatinu proteiny. Tlumiče poskytují obzvláště kompaktní balení heterochromatinu, euchromatin, který zabraňuje tvorbě smyček. Chromatinový balíček zprostředkovaný těmito proteiny koreluje s celočivotností genomu ESC. V současné době zjištěno, že zralé vejce u skotu a člověka jsou jediný druh specializovaných buněk, které obsahují vysoké koncentrace tlumičů proteinů v cytoplasmě. Na tomto základě, a byl vyvinut způsob získání hybridních HSR o přenosu jader somatických buněk v kravském vajíčky nejaderného. Předběžné studie in vitro ukázaly, že cytoplazma oocytů krav obnovuje totipotencí genom lidských somatických buněčných jader po 12-24 hodinách kultivace.

Zvláštní význam mají údaje o vlastnostech předimplantačního vývoje lidských embryí, které naznačují pozdější náhradu totipotentních buněk populací pluripotentních buněk než u myší. Studie buněčných transformací ukázala, že buňky interní buněčné hmoty lidského blastocysty kromě ESC také vytvářejí tropoblastové buňky, což naznačuje jejich celkovou účinnost.

Je známo, že ve stádiu blastocysty existují dvě odlišně spjaté buněčné populace. Jednou z nich je vnější vrstva blastocysty, trofektoderm, odvozený z trofoblastových buněk a dalších komponent embryonální placenty. Druhá populace buněk je seskupena do husté hmoty, která se dotýká vnitřního povrchu trophectodermu. Buněčná populace vnitřní buněčné hmoty pochází ze všech tkání a zárodků embryonálních orgánů. Ve stádiu pozdního blastocystu se z vnitřní buněčné hmoty vytvoří extra-embryonální endoderm a vytvoří se epiblast (primární ektoderm). Současně si epiblastové buňky udržují pluripotenci, zatímco schopnost diferencovat buňky extratermálního endodermu je omezená.

[7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15]

Získání lidských embryonálních kmenových buněk

Až do nedávné doby se věřilo, že trofoblastu získány z hESCs nemožné. Nicméně diploidní linie trophectoderm kmenové buňky izolované z blastocysty v médiu, které obsahuje, místo toho, LIF a FGF2 heparinu, šíří a je transformován do kmenových buněk. Máte-li odstranit ze svého středu FGF2 se trophectoderm buňky přestanou chov, začnou endoreduplikace chromozomů a buněčných elementů trofektodermalnye postupně přeměněna na obří trofoblastu. Pravděpodobně, LIF nestimuluje proliferaci trophectoderm buněk vzhledem k tomu, že FGF2 spouští mechanismus transsignalizatsii jako FGF2, vazbu na cytoplazmatické receptor (FGFR2), kinázy MAP v cytoplazmě - ERK1 a ERK2. V důsledku toho, když je začleněn do buněk blastocysty jedné signální dráhy (LIF - gpl30 - JAK kinázy - STAT3) buňky vnitřní buněčné masy jsou transformovány na pluripotentní hESCs, přičemž aktivace druhého mechanismu transmembránového signalizace (FGF2 - FGFR2 - MAP kinázy ERK1 / ERK2) V blastocystu se tvoří kmenové buňky trophectodermu. Volba signální dráhy, zase závisí na aktivitě genu Oct4. Tento gen patří POU doména, která se nachází v lokusu t 17 autozomů a je exprimován během oogeneze, v drcení období, stejně jako v buňkách vnitřní buněčné masy blastocysty, a v prvotních zárodečných buněk. Funkční role Oct4 gen kódující transkripční faktor nezbytný pro vznik pluripotentních buněk, jejich diferenciaci a dediferenciace.

Exprese genu oct4 v ESC se mění v závislosti na interakci tohoto transkripčního faktoru s kofaktory. Směrná regulace exprese oct4 v blastocystách ukázala, že když se její aktivita snižuje, polovina buněk tvoří trophectoderm, zatímco s nárůstem indukované exprese oct4 převažuje ESC.

V experimentu, ESC nelze přeložit do řady kultivací totipotentní blastomery štěpení fázi a ve fázi gastrulation a pozdějších stadiích embryonálního vývoje. Myš HSR obvykle přidělit na 3,5-4,5 dnech březosti, což odpovídá šesté (jedné vrstvy blastocysty) a sedmé stupních (dvouvrstvých blastocysty - raně vejce válec) normální embryogeneze. Je zřejmé, že embrya myší obsahují pouze v předimplantačním období buněčnou populaci, která může být přeměněna na ESC. V důsledku toho je izolace linií ESC možná pouze v určitých stádiích embryogeneze. Totipotent, pokud jde o příležitosti pro rozvoj životaschopného embrya ze zárodečných obalů a placenty jsou zygota a vznikající při drcení blastomer. Ztráta celkové účinnosti germinálních buněk začíná v pozdní morální fázi, kdy další rozmělnění blastomem závisí na jejich umístění. Brutální blaetomery Morula si zachovávají všudypřítomnost, protože experimentální manipulace se změnami v jejich umístění, například inverze jejich umístění, nebrání vývoji plného embrya.

Bylo zjištěno, že účinnost uvolňování ESC v linii je ovlivněna stavem blastocyst v době jejich explantace. Použití blastocyst po sedmidenní simulaci diapauzy v genitálním traktu myší, s odebranými vaječníky na 3,5 dne březosti a léčených progesteronem a přispívá k úspěšné oddělení linií embryonálních kmenových buněk. Předpokládá se, že za takových podmínek se zvyšuje počet blastomerů tvořících vnitřní buněčnou hmotu. Je také možné, že se buněčný cyklus rozšiřuje a většina blastomerů vstoupí do fáze G0.

Kromě toho je vytváření stabilních pluripotentních embryonálních kmenových buněk linií závisí na genotypu embrya: poměrně snadno rozlišit od HSR myších blastocyst vedení 129, je podstatně těžší je získat za použití myší CS7BL / 6 a prakticky nemožné izolovat řádek z hESCs blastocyst CBA / Ca myší. Je zřejmé, že rané embrya mají některé genetické vlastnosti, které ovlivňují vývoj pluripotentní linie ESC. Nicméně, když jsou kultivovány epiblastu izolací, stejně jako selektivní výběr diferenciační buněčné linie hESCs z časných embryí CBA / Ca myši byly dosud přiděleny.

Osvědčená standardní technika pro získání linií ESK z blastocystů je uvedena v laboratorních manuálech o technice experimentování s ranými embryi. Experimentální linie ESK lze také získat kultivací izolovaného epiblastu (primární ektoderm) 4,5denních myších embryí s poměrně složitou mikrochirurgickou technikou a modifikovanými kultivačními podmínkami. Složitost tohoto postupu je odůvodněná, protože frekvence tvorby linií ESC byla mnohem vyšší než při práci s vnitřní buněčnou hmotou blastocysty.

Pro izolaci linií ESC se každý klon přenese do mikrotitrační jamky, pěstuje se agregát o velikosti 40-60 buněk, opět se rozptýlí. Několik opakování tohoto postupu umožňuje získat imortalizované linii ESK maximálních rychlosti proliferace normokariotipnyh buněk navázaných na plastu, který průchody 50-100 udržení totipotencí a vysokou telomerasovou aktivitu. V procesu podpůrné linie ESC největší nebezpečí je, že znečištění nebo sérové bakteriální endotoxiny - i stopy koncentrace endotoxinu v kultivačním médiu způsobil masové smrt nezralých zárodečných buněk. Při pečlivém řízení lineárního růstu a včasné disperze HSR v kultuře jsou schopné symetrického štěpení, ve kterém oba dceřinné buňky zůstávají pluripotentní a je schopen provádět neomezený počet buněčných cyklů, udržuje diploidní karyotyp a celkovou účinnost.

Volba čisté populace lidských HSR může být provedena po transfekci do svého genomu rekombinantní DNA molekuly, které obsahují gen kódující syntézu zelený fluorescenční protein (GFP). Exprese GFP se zvyšuje s rostoucí HSR v prostředí podporujícím jejich proliferaci, zatímco začátek diferenciace úrovně genové exprese snížena, což umožňuje, vybraných na selektivním médiu čistých stabilních pluripotentních buněčných linií. Při kultivaci izolovány pomocí GFP-výběr frekvence zvyšuje tvorba PGC kolonie tolikrát, kolik je v podmínkách chovu plodin odstraněny silný antiproliferativní účinek diferencovaných buněk.

Překlad lidských embryonálních kmenových buněk, v souladu prostřednictvím způsobu jejich izolace preimplantačních embryí (krok 80-120 buňky), které zůstávají po in vitro fertilizace postupu v. Chcete-li to synteticky „přebytek“ embrya mechanicky rozptýlené v jehle střední Delbekko. Po značení buněk monoklonální protilátky selektivní fluorescenční značkou embryoblast izolovaných buněk. Embryoblast rozptýlí do jednotlivých buněk se směsí kolagenáza-dispáza. Disociované buňky byly pěstovány ve speciálním médiu (80% Delbekko střední + 20% fetálního telecího séra v přítomnosti 500 ug / ml IL-6, LIF a SCF) na monovrstvě embryonálních fibroblastů podavač 3 první pasáže. Tak přežití a proliferace kmenových a progenitorových buněk se udržuje působením IL-6, LIF a SCF. V tomto prostředí, závěsné hESCs růst klonů osharennyh nepřipevněnými buněk, který má být rozložen opatrným vícenásobné pipetováním. Nové klony vznikají v suspendované kultury v 5-7-tého dne. Maximální rychlost růstu dosáhnout ESK opakované klony disociačních krok 10-15 buněk. Potom každý klon byl převeden do mikrobuňky a pěstovány až do nahromadění 40-50 buněk. Tento postup se mnohokrát opakuje v průchodech, zvýšení objemu kultury na hustotu 5-10 milionů buněk na 6-cm misky. Použitím takové Thomson pasážování byl izolován 10 klony imortalizovaných lidských HSR který průchody 100 si zachovávají vysokou telomerasovou aktivitu, schopnost intenzivní proliferaci a fenotypových charakteristik minimální celkový účinnosti, s diferenciací v některém z 350 specializovaných buněčných linií, které jsou odvozeny bez-, mezo- - a endoderm. Diferenciace lidského ESC začal (při změně střední, přidání a odstranění séra LIF) s přichycení buněk k podkladu, což ukazuje vývoj cytoskeletu a exprese adhezních receptoru. Je důležité, že neomezená proliferace lidských HSR udržuje normální karyotyp.

Druhý způsob izolace lidských linií ESC je založen na použití primárních pohlavních buněk. Experimentální studie ukázaly, že Eu-buněčné linie mohou být získány z genitálních plaků embryí myší starších 12,5 dne. V těchto případech však byla frekvence tvorby progenitorových buněčných linií významně nižší než u experimentů se staršími embryi. Současně jsou primární pohlavní buňky z pohlavních embryí myších embryí 13,5-denního gestačního věku obecně neschopné transformace do linií.

První stabilní linie lidských pluripotentních EG buňky byly získány z primárních gonocytes izolovaných z pohlavních primordií 5-9 týdnů starých embryí. Izolované buňky byly kultivovány na podkladu inaktivovaných myších embryonálních fibroblastů v médiu DMEM s fetálním sérem, ke které se přidá merkaptoethanol, forskolin, stejně jako rekombinantní lidské růstové faktory (FGF a LIF). Po 7-12 dnech v kultuře byly mnohobuněčné kolonie morfologické vlastnosti a molekulární markery odpovídající EG-lidské buňky. Po agregaci, tyto buňky vytvořené embryoidních tělísek, další vývoj specializované buňky, které se objeví charakteristická pro deriváty všech tří zárodečných vrstev. Během 10 až 20 pasáží zůstaly EG buněčné linie zachovány normální karyotyp a neztratili pluripotenci.

Ukazuje se také, že kombinovaný účinek LIF, membránově vázaných a rozpustných ocelových faktorů, stejně jako TGF-b, modifikuje program pro vývoj primárních zárodečných buněk. Namísto zastavení mitotických dělení a začínající diferenciace k oogenesi nebo spermatogenezi se primární pohlavní buňky stále rozšiřují. Po několika dalších mitotických cyklech se stávají podobnými epiblastovými buňkami a ztráta vlastností prekurzorů zárodečných buněk je přeměněna na pluripotentní buňky EG embryonálních kmenů.

Tak, v roce 1998, z sexuální klíčků pitevní fetální lidské tkáně byly poprvé izolovány imortalizované linii primordiálních zárodečných buněk. Embryogeneze lidských zárodečných buněk primárních objeví v žloutkového váčku ve třetím týdnu vývoje a na 4-5th týdnů, tyto buňky migrují do oblasti sexuálního nádoru, kde tvoří populaci primárních dormantnye gonocytes. V neaktivním stavu zůstávají primární zárodky buňky až do narození. Primární zárodečné buněčné linie byly získány z plodových genitálního hrbolku 5-9 týdnů starých embryí získaných ex tempore tkanina, která se nechá reagovat se směsí kolagenáza typu IV-V, hyaluronidázy a DNázou pro kvantitativní a kvalitativní výtěžek zvýšení buněk. Primární zárodečné buňky v tkáních plodu genitálního tuberculum obklopen stromatu (mesenchymálních) Sertoliho buněk. Funkční účel Sertoliho buněk je výroba antiapoptotických faktorů (Fas ligand), mitogeny, a imunosupresivní činidla, která chrání sexuální kmenových buněk z imunitního napadení těla. Kromě toho, stromální mikroprostředí genitální nádor hraje důležitou roli při zrání gamet. Izolované primární zárodečné buňky v kultuře jsou zasazeny nad podavače stromální vrstvy sestávající z fibroblastů z fetálních prvních tří pasáží. Nejúčinnější kombinace mitogenů je rozpoznán jako celek sestávající z LIF, FGF a forskolinu (tvorba stimulant cAMP). Proliferační primordiální zárodečné buňky in vitro vyžadují přidání fetálního séra, v přítomnosti primárních reprodukčních gonocytes v kultuře klonů doprovázené tvorbou globulárních, non-adherentních buněk k podkladu.

Americká National Institutes of Health na základě shrnutí stávajících informací o způsobech přidělení lidských linií HSS z blastocysty byl proveden předběžný závěr, že úspěšné přidělení ESC je s největší pravděpodobností při kulturních a společenských blastocysty s dobře vytvořeným embryoblast (Kmenové buňky: vědecký pokrok a budoucí výzkumné směry Nat. Inst, Health USA). Z tohoto hlediska je nejlepším zdrojem HSR k vytvoření linky jsou lidské blastocysty 5. Den vývoje, jehož přidělení vnitřní buněčné hmoty, by měl být pečlivě odstraněny trophectoderm. Izolované vnitřní buněčná hmota se skládá v tomto stadiu 30-35 buněk musí být kultivovány na substrátu embryonálních fibroblastech myší, což je rozhodující podmínkou pro tvorbu kolonií v kultivačním hESCs.

Analýza fenotypových vlastností embryonálních kmenových buněk

Zvláštní zájem je mezidruhová srovnávací analýza fenotypových vlastností ESC. Bylo zjištěno, že lidské ESC kolonie - husté shluky vyrovnaných epiteliálních buněk, zatímco myši embryoidních tele se skládají z volné konglomerátu zaoblených buněk. V lidském ESC je poměr poměru jaderné plazmy nižší než u myší ESK. Embryonální kmenové buňky opic tvoří více plochých buněčných kolonií s nerovnými okraji. V počátečních klonech primátů ESC jsou snadno vidět jednotlivé buňky. Proliferující ESC všech studovaných druhů zvířat nevyjadřuje molekuly MHC první a druhé třídy. Ve stejné době, lidské HSR poskytnout pozitivní odpověď na protilátky TERA 1-60 a GCTM-2, který ukazuje na přítomnost na povrchu keratin / chondroitin sulfát proteoglykany, charakteristické pro embryonální (teratomy) -kartsinomnyh kmenových buněk. Exprese v hESCs všech druhů zvířat Oct4 genu naznačuje, že i přes fenotypové rozdíly v lidských a myších HSR, zřejmě podle stejné sady genů odpovědných za udržování pluripotence (Peru, 2001). Kromě toho vedení ESC odvozené z embryonálních krys, prasat, králíků, primátů, a dobytek, mají podobné morfologické charakteristiky, podobný soubor molekulární identifikaci markerů a téměř totožný molekulární mechanismus pro provádění programu embryogeneze, který umožňuje, aby se nový pohled na problematiku xenotransplantace .

Na rozdíl od normálního embryogeneze in vivo, in vitro proliferaci hESCs není doprovázena tvorbou zárodečných vrstev, a pokračuje do bloku Homeotické Nohgenov pozadí, to znamená, aniž by organogeneze. Vzhledem k tomu, segmentace geny nefungují v kultuře hESCs nelze reprodukovat takové období embryogeneze jako karta somit segmentace jádra, tvorbě žloutkového váčku, allantois provizorní a dalších orgánů a tkání. Kultury ESC byly zmraženy na počátku vytváření 350 restrikčních linií specializovaných buněk. Tak, klon pomocné progenitorové buňky a centrálně lokalizované PGC jsou Model embryo během vývoje, v němž jsou různé regiony tkáně vytvořený v jednom stupni se liší od specializovaných buněk odvozených však z běžných prekurzorů. I když minimální úrovni receptorů na povrchu hESCs, si zachovávají schopnost provádět primitivní morfogenetické procesy simulující většinu struktury raného embrya v suspenzi hESCs v kultuře a kameniva tvoří strukturu připomínající blastocysty nebo dokonce vyšší embrya (vaječné válce). Takové suspenze agregáty byly vhodně nazývány jednoduchými a komplexními embryoidními tělísky.

Ve směsi diferencovat do různých buněk embryoidních těla současně exprimovaných geny časné ektodermu (OCT3, FGF-5, nodální), endoderm (gata-4), mezodermu (brachyury), kardiogenní mezodermu (PKH-2,5), neurální trubice (msx3 ) a hemopoézu (elkf). Pomocí různých kombinací cytokinů a růstových faktorů pro cílení tvorbu zárodečných vrstev buněk in vitro v řadě případů bylo možno získat embryoidních tělísek, které byly s výhodou exprimovaných genů ektodermu nebo mezoderm, která otevírá cestu k modelování gastrulation a časné fázi organogeneze.

Klonální růst hESCs je důkazem asymetrického buněčného dělení, ve kterém pouze jeden ze ESC ve středové klonu zachovává neomezující schopnost reprodukce, zatímco druhá dceřinná buňka vede k vytváření progenitorových buněk, diferenciace je již dovnitř. Proto je míra násobení klonu na obvodu embryoidního těla vyšší než ve středu. Okrajové buňky rostoucího klonu podléhají spontánní poruchové diferenciaci, migrují nebo umírají mechanismy apoptózy. Tyto události určí osud klonu v případě, že rychlost šíření vyšší než rychlost migrace a apoptotické buněčné smrti, klon velikosti i nadále zvyšovat, stabilizaci dochází se stejnou apoptózy a rychlost tvorby nových rychlosti buněk, regrese - obráceném poměru těchto procesů. Progenitorové buňky se rozdělují symetricky, to znamená, že obě dceřinné buňky jsou dále diferencovány do zralých specializovaných buněčných linií. Poměr ESC / progenitorových buněk se liší, ale je vždy počet kontaktních míst, je jen zlomkem jednoho procenta populace progenitorových buněk. Proto pouze opatrná pipetování a včasná disagregace klonů mohou zvýšit počet kultur ESC. Pro dosažení maximálního výtěžku ESC bylo nejúčinnější rozdělit klony ve fázi 10-12 buněk. Směr a stupeň diferenciace buněk v embryoidním těle závisí na jejich umístění. Vnější embryoidních těla buňky neexprimují gen a Oct4 podstoupit diferenciaci primárních endoderm buněk, ze kterých následně vytvořených epiteloidní buňky a parietální extraembryonálních viscerální endoderm. Vnitřní buňky embryoidního těla exprimují gen okt4 a udržují pluripotenci po dobu 48 hodin kultury. Ale pak morfologické reorganizace se vyskytuje v epiteliálních monovrstva buněk začíná a expresi genů, které řídí vývoj primárního ektodermu. Pak začíná proces úplné neuspořádané cytodiferenciace s výskytem různých buněčných typů, které jsou deriváty všech tří zárodkových listů. V procesu spontánní diferenciaci embryoidních tělesných buněk nejprve vznikají agregáty, endoderm markery ve formě fragmentů (cysty) žloutkového váčku. Dále se v těchto strukturách objevují angioblasty a endotelové buňky růstových kapilár. V závěrečné fázi spontánní diferenciace vnitřních buněk embryoidních těla vyvíjí různé terminálně diferenciované buňky, včetně neuronů, gliových prvky, kardiomyocytů, makrofágy a erytrocyty. V určitém přiblížení (s ohledem na prostorové inverzi listů tvořících embryonální tkáně) přes embryoidních tělísek in vitro může zkoumat morfogenetické procesy a analýzu molekulárních mechanismů embryonální cytodiferenciační počátečního období, a stanovit roli specifických genů při provádění těchto procesů.

V klonu jsou tedy buňky, ve kterých jsou objeveny různé programy genetického vývoje - ESC, ranné progenitory a diferenciační progenitorní populace. Kultivace ESC způsoby poklesu nebo masové kultury bez podávací vrstvy a bez přidání LIF v médiu nevyhnutelně vede k tvorbě embryoidních těl. Morfologie buněk vnějších a vnitřních vrstev embryoidních těl je odlišná. Vnější vrstva se skládá z velkých procesních buněk. Jejich povrch, obrácený k životnímu prostředí, je pokrytý četnými mikrovilli. Vnější vrstva buněk je oddělena od vnitřní bazální membrány, která se podobá membráně Reichert, zatímco buňky vnitřní vrstvy embryoidních tělísek jsou válcovitým epitelem. Morfologicky, vnitřní vrstva, i když obsahuje mnoho dělících buněk, více připomíná nediferencované kolonie ESC.

Vlastnosti lidských embryonálních kmenových buněk

Absence parenchymálních-mesenchymálních interakcí na pozadí signál blokující geny homeosis způsobuje neuspořádanou růst PGC v kultuře, protože tato karta je přerušeno a tvorbu infrastruktury provizorní orgány. Neorganizovaná růst a neuspořádaný spontánní diferenciaci hESCs v kultuře v důsledku nedostatku mesenchymálních značení stromální rámec budoucích orgánů: in vitro, je možné, že tvorba milionů hepatocytů, ale nemůže dostat žádné segmenty jater, včetně takových strukturních a funkčních prvků, jako jsou například dutin, prostoru Disse a Kupfferových buněk.

Má se za to, že pluripotenci HSR realizován výhradně v embryogenezi tvoří tkáně a orgány embrya, zatímco pupeční šňůry a placenty jsou odvozeny trofoblastu. Uzavřen v plášti trofektodermalnuyu ESK důsledně generovat klony provizorní realizaci vývojový program kombinační mRNA hromadné Nohteyaov topografické matrice, které předurčují prostorového uspořádání, tvar, rozměry, počet průběžných a konečných orgánových buněk a montáž parenchym do strukturní a funkční jednotky. Zároveň ESC se jako jediné buňky, ve kterých molekulární mechanismus realizaci jejich potenciálu zcela oddělit od genetického programu vývoje a poskytovatelé energetických služeb se zbavena možnosti interakce s ostatními buňkami v důsledku zablokování obou vnímání receptorů a transsignalizatsii systémů. Avšak odpovídající aktivační otáček má za následek postupné nasazení embryogeneze programu koncového narození je kompletně vytvořena a připravena k životu extrauterine organismu složené z miliard buněk. V tomto krátkém čase, ale nepředstavitelné dluh v buněčném prostoru cesta nevyhnutelnému výskytu chyb v molekulárních mechanismů, které poskytují důležité funkce buněk, a programů, které řídí jejich proliferaci, diferenciaci a specializaci. Proto se v moderních farmakogenomiku posuzovat odděleně onemocnění molekulárních zařízení a programování buněčné onemocnění. A působení většiny nových léků zaměřených na korekci název programu diferenciace, proliferace a organogeneze, stejně jako regeneraci orgánů a tkání. V dospělém organismu přes HSR se stane možné řídit chování kmenových / progenitorových buněk transplantovaných do mozku, jater, sleziny, kostní dřeně a dalších orgánů lidského oprava poškozené příjemce parenchymálních orgánů kvůli odlišnosti a specializace dárce mezenchymálních buněk konzervovaných matice. V podstatě, totipotencí Program zahajuje další oocytů genomu úrovně, zygoty a blastomer, ale tyto buňky ještě není možné klonovat a pasážovány v množstvích nutných pro potřeby experiental a praktické medicíně. Proto je ESC je jedinečným zdrojem genetické informace, která obsahuje trojrozměrný lineární restrikční mapu embrya a kódy specializovaných buněčných linií během gastrulation.

Prakticky neomezené možnosti regeneračního regulátoru s ohledem na skutečnost, že jejich genomu, na rozdíl od genetického aparátu diferencovaných somatických buněk, udržuje pluripotenci. Jedním projevem nečinném stavu kořeny v HSR genetické informace je tzv minimální fenotyp - na povrchu HSR vyjádření omezený počet receptorů, a tudíž nasazen jen velmi málo programů pro interakci transsignalizatsii jaderné aparát buňky s jeho mikroprostředí. Na pozadí hibernace genů zodpovědných za omezení specializovaných buněčných linií a diferenciace buněk, aktivuje pouze asi 30 500 genů, jejichž produkty poskytují komunikační buňky s okolní mikroprostředí. Za použití metody sériové analýzy genové exprese je znázorněno, že obecnost hlavní funkční genom krabic regulujících energii a metabolismus v somatických buňkách a HSR v posledním určeném extrémně nízké množství mRNA receptorů, G-proteinů, druhých poslů, transkriptáz, kofaktory expresi a represi to znamená, že celý systém transmembránový regulační signál do buňky. To je vzhledem k nedostatku nebo velmi nízkou expresi genů transsignalizatsii. Během diferenciace indukované v genomu ESC 18 zastavení provozu synchronně funkční geny pro pozadí aktivace transsignalizatsii 61 genu, který řídí syntézu buněčných adhezních receptorů, složky extracelulární matrice, omezení transkriptázy messendzhernyh prvky a vysílání signálu systému pro jaderného bloku s plazmou receptory buněčné membrány. Současně blokována exprese genů zodpovědných za syntézu proteinů tlumičů hluku, jakož i genovou expresi koingibitorov poskytuje totipotencí genomu hESCs.

Byly nalezeny genetické markery pro buňky všech tří embryonálních letáků. Identifikace ektodermální vrstva buněk provádí na expresi genů uzlové, OCT3 a FGF-5, mesodermálních buňky - gen brachyury, zeta-globinu, endoderm - na gata-4 exprese genu. V normálním embryogenezi, během gastrulation pozorována aktivní migraci nezralých populací kmenových a progenitorových buněk, lokálně označení oblasti obličejových kostí lebky, některé části mozku, periferního nervového systému, srdeční systém a brzlíku tkání, které jsou tvořeny z klonů posunuta buněk. Označování buněk časné geny zárodečné vrstvy usnadňuje topografického analýzu migrace progenitorových buněk ve vyvíjející se embryo. Je zjištěno, zejména to, že buňky v agregáty embryocarcinoma P19 exprese prvního genu mesoderm brachyury začíná během redukce genové exprese tkáňového plasminogenového aktivátoru, a-fetoprotein, keratinu 8 a keratinu 19, které jsou markery brzy mesodermální tažných populací. V důsledku toho je tvorba tkáně mesodermálního původu začíná teprve po procesu migrace a usazování bodových mesodermální progenitorových buněk.

Při extrémně omezenými funkcemi fenotypické a nepřítomnosti většiny bloků transsignalizatsii HSV však má některé receptorové molekuly, které mohou být použity pro jejich identifikaci. Je pozoruhodné, že tyto antigeny jsou markery ESC u lidí a primátů byly běžné. Nejčastěji se používá pro označování hESCs značených protilátek na antigeny membrannosvyazannym SSEA-3, SSEA-4 (unikátní lipidové antigeny představující komplexní glykolipid GL7 s sialové kyseliny), stejně jako vysoké polymery glykoproteiny TRA-1-81, TRA-1-60. Dále hESCs exprimovaly specifické embryonální antigen SSEA-1 a endogenní alkalické fosfatázy, stejně jako specifický transkripční faktor Oct4. Ten je potřeba pro udržení proliferace hESCs mechanismy - specifický transkripční faktor, Oct4 gen aktivuje expresi fibroblastový růstový faktor 4, genové exprese a stabilizuje box odpovídá za neomezující DNA zdvojení v nezralých buňkách. Mezi nejdůležitější intracelulární signální proteiny jsou OCT3, Oct4, Tcf a Groucho, vztahující se k proteinům chromatinu-tlumičů.

Téměř okamžitě po dlouhodobých kultivovaných pokusů HSR je neúspěšné a organismus se nejprve připraví kultury kmenových buněk izolovaných z myších blastocyst a primární zárodečné buněčné kultury, začal stádia ESC pluripotenci studie kapacity, když se podává v raných fázích vývoje embrya. Ukázalo se, že při moruly a blastocysty PGC jsou schopny tvořit chimérické embrya, ve kterém detekován dárcovské PGC potomci ve všech somatických tkáních, a dokonce i v gamet. Tak, v Developmental Biology pomocí ESC skriptovacího „můstek“ mezi experimentálních studií in vivo a in vitro, které se významně zvýšily možnost studovat procesů záložky primárních tkání a orgánů, jejich diferenciaci a embryonální organogenezi.

Je dobře známo, že in vivo v průběhu embryogeneze integrován ESK do buněčné hmoty časného embrya, a jejich deriváty se nacházejí ve všech orgánech a tkáních. ESC kolonizují v chimérickém embryu řadu pohlavních buněk, jejichž potomci tvoří plnohodnotné ovuly a spermie. Embryonální kmenové buňky jsou klonogenní - jednotlivé PGC mohou vytvářet geneticky identické s kolonie buněk molekulárních markerů, které zahrnují Oct4 genovou expresi a alkalickou fosfatázu, vysokou telomerasovou aktivitu, stejně jako expresi specifických zárodečných antigenů.

Pro studium mechanismů embryogeneze pomocí techniky hESCs chimerization morulu vytvořením biologické struktury, která se nachází mimo vrstva tetraploidní blastomery příjemce a dárce PGC se podávají do. Tak, trofoblast vytvořeny z potomků tetraploidní blastomer příjemce, který umožňuje implantaci a placenty a dárcovské PGC působí jako vnitřní buněčné hmoty, která je tvořena z životaschopné zárodečné linie primárních těla a progenitorových gamet. Studie ESC hodnota spočívá nejen v tom, že, když je manipulace in vitro s jejich genomu zachovány pluripotenci, ale také v tom, že při zachování schopnosti podílet se na tvorbě hESCs prvotní zárodečných buňkách Chimérické embryo. Je ukázáno, že pouze jeden potomci geneticky modifikovaných PGC kolonizovat všechny primární a choroboplodné zárodky, které tvoří tkaninu Chimérické embryo získané agregací nebo kultivace buněk s 8-buňky embrya. Když transplantovány myši morula HSR transfekovaných zeleného fluorescenčního proteinu genu fluorescenční potomci buněk byly zjištěny ve všech zkoumaných tkáních vyvíjejícího se embrya (Shimada, 1999). Transplantace ESC v morulu může vytvořit životaschopné myší, tělo, které se skládá výhradně z potomků daroval ESC, která otevírá příležitosti pro celou řadu léčebných možností klonování. Právě takový metodický přístup byl úspěšně aplikován studovat problémy vývojové biologie, zejména, může analyzovat genetické mechanismy inaktivace chromosomu X nebo epigenetické nestability hESCs. Transplantace ESC do raného embrya se také používá v biotechnologii v zemědělství, stejně jako v experimentech genové terapie.

Transplantace geneticky modifikovaných ESC se používají k testování cílových buněk mutantních genů. HESCs kultivované in vitro použití v biotechnologii k vytvoření knockout myší. Pro tento účel, pomocí homologní rekombinace, které mají být odstraněny z HSR studie genové (knock-out) a selektivní média vylučují buněk postrádajících tento gen. Pak knockout PGC vstřikuje do blastocysty nebo nosit s blastomer moruly agregace. Takto získané chimérní časných embryí se přesadí do recipientní samice a novorozené myši zvolen z jedinců s gamet, nullizigotnymi tohoto genu. Podle této technologie vytvořená počtu řádků knockout myší, které jsou široce používány v experimentální biologii a experimentální medicíny. Na těchto biologických modelů studoval hodnoty určitých genů v embryonálním vývoji, stejně jako jejich roli v mechanismech nemocí a patologických stavů u lidí. Navíc se v předklinické testovací fázi nových metod genové terapie používají linie vyřazených zvířat. Například pomocí genové transfekce v ESK normální alely mutovaného genu efektivně řídit opraven mutaci, zasahuje hemopoetických systému. Zavedení cizích genů do HSR umožňuje rychle vytvořit linie homozygotní transgenní laboratorní zvířata. Mělo by však být poznamenáno, že delece genu rekombinační technikou zaměřen spolehlivě zpracován dosud jen relativně ESC myší. Použití myší s dvojitou mutací, HSR nainstalován funkční roli shluk oblasti genů na chromozómu 7 (kopií genomové oblasti 19 minut lidského chromozomu) a proximální část 11. Chromozomu (kopie lidského 5d chromozom) - vypuštění těchto genů v ESK myši umožnily vyhodnotit funkci jejich analogů u lidí.

Funkční kapacita studie lidských embryonálních genů, transfekce v genu, který laboratorní zvířata povolena hESCs zejména CRYPTO vyjasnit úlohu genu na kartě a tvořících gen kardiogenní mezodermu, Pax-6 - v embryogeneze oka. Představuje první expresi genů v nezralé proliferující karty ESC teratokarcinomu a blastocysty myši potvrzeno ohromující represe v transsignalizatsii genech ESK. Kombinace mutantních HSR 60-80 a 20-30 buněk normálních preimplantační myších embryí vede ke vzniku chimérických embryí ve které záložky tělo se skládá z dárce a příjemce buněk, který nám umožňuje určit úlohu neznámých genů v gastrulation a organogeneze. Funkční mapa zvětšených genových vývoji myších embryí detaily role genu kartě SF-1 v nadledvinkách a pohlavních primordií, hmotnostních 1-gen - v ledvinách kartě myod genů rodiny - na kartě v genové rodiny kosterního svalstva gata-1-4 - v omezení zrání základy erytro- a lymfopoézy.

Režie mimo mateřské a otcovské alely genů v hESCs použitím vektoru rekombinázu sloužil k objasnění funkce různých genů v průběhu časné embryogeneze a technologie cílení lidských neznámých genů v myších HSR přispět k objevu nových mutovaných genů zodpovědných za rozvoj závažných dědičných onemocnění. Pomocí metody knockout definován obligátní význam některých genů, pro kterou se embryonálních tkání: gata-4 - pro myokardu, gata-1 - na erytroidních hemopoetických tkání, MyoD - kosterní svalstvo, brachyury - pro omezení mesoderm transkriptázy hnf3 a hnf4 - pro jaterní kmenové buňky, hadr-2 - odkazy na klony T a B lymfocytů (Repin, 2001). Double delece genů v hESCs otevřela přístup ke studiu funkční role genů zárodečné vrstvy, segmentace a homeosis a transplantaci ESC dané možnost získání životaschopné mezidruhové hybridních embryí. S zlepšených způsobů transplantace dárcovských PGC v jednom 8-buňky embrya prokázáno, že chimerization na buněčné úrovni mnoha orgánů přijímající embrya. Všimněte si, že mobilní klíčky se nacházejí v příjemce tkáně myších orgánech člověka po podání lidských krvetvorných buněk do blastocysty. Bylo zjištěno, že v myších embryí během tvorby krevních těles obíhajících pluripotentní hESCs. Je možné, že jejich biologické funkce je organizace budoucího plodu imunitního systému. ESC in vitro reprodukovány vhodné modely lidské genetické choroby: s dvojitou mutací modelům dystrofinového genu u myší DMD, vypnutí atm genu (řídicí signál syntéza kináza chromatinu) - ataxie-teleangektaziyu. V tomto případě, fatální dědičné onemocnění u dětí v důsledku vad opravy DNA vyvíjí degeneraci Purkyňových buněk v malém mozku, které je doprovázeno involuce brzlíku vzhledem ke smrti proliferujících buněk. Klinika, patofyziologie a patomorfologija ataxie-teleangek- tazii reprodukované prostřednictvím zavedení do HSS abnormální genetické informace z myší chiméry na odpovídají těm, které u lidí. Dále ataxie-teleangektazii pomocí PGC a knockout myší vyvinuty experimentální model, některé dědičné homozygotní lidských onemocnění souvisejících s poruchami metabolismu sacharidů a lipidů, katabolismus aminokyselin, odstranění mědi a bilirubinu, což významně zvýšila možnost experimentální medicíny pro preklinické testování nových metod pro léčení příslušných nemocí osoba.

[16], [17], [18], [19], [20]

Použití kyothybridních kmenových buněk

Hybridní buňky získané fúzí somatických buněk od hESCs, jsou vhodné a perspektivní modelem pro studium kmenových buněk pluripotenci a úpravu diferencovaných buněčných chromozomů. Tsitogibridy získaný fúzí ESC s diferencovaných buněk dospělého zvířete, poskytují příležitost ke studiu vztahu mezi genomy různých „věku“: vytváří jedinečnou situaci, kdy homologní chromozómy odvozené z buněk různých stádiích diferenciace, a měnící se stupně zralosti, jsou ve stejné jádra, kde se dá snadno transdeystvuyuschimi sdílet regulační signály. Je těžké předvídat, jak bude reagovat tsisregulyatornye epigenetická systém homologních chromozomů existujících během yn rozdělený vývoj, v reakci na dopad transdeystvuyuschih signálů z embryonálních příbuzných genomů. Kromě toho, v hybridních buňkách dochází k segregaci rodičovské chromozomu, která umožňuje studium interakce genomů na samostatné úrovně chromozómů, to znamená, potenciálně oddělit část specifických chromozomů v udržování pluripotence, nebo naopak, výstup v diferenciaci.

Jako první experimentální model pro studium interakce genomů jiné „historii vývoje“ použitý tsitogibridy získat sloučením teratokartsinomnyh pluripotentní a diferencované somatické buňky. V některých případech tyto hybridní buňky uchovávají pluripotentní vlastnosti na dostatečně vysoké úrovni. Zejména, in vivo somatické hybridní teratokartsinomno-buňky byly indukovány vývoj pravých teratomů obsahujících deriváty všech tří zárodečných vrstev, in vitro v suspenzní kultuře, vytvořených embryoidních tělísek. I v tomto typu mezidruhových tsitogibridov poznamenat přítomnost fetálních antigenů v případech, kdy somatická partnerem fúze s teratokarcinomových buněk byly lymfocyty nebo thymocytů. Je pozoruhodné, že tsitogibridy fúzí teratokartsinomnyh buněk fibroblastů, v souladu s fenotypem fibroblastů.

Nejdůležitější je, že známým faktem, že v-teratokartsinomno somatické hybridní buňky se objevil Známky genomu úpravu diferencovaných buněk, vyznačující se tím, reaktivaci jednotlivých genů nebo neaktivní X-chromozómu somatické partnera. To znamená, že výsledky výzkumu na typu buněk tsitogibridah teratokartsinomno-somatických ukazují, že hybridní buňky často i pluripotenci a přeprogramování genomu existují známky somatické partnera.

V experimentech pro získání embryonálních Vnitrodruhová hybridních buněk fúzí splenocytů myší HSR dospělé zvíře studovány vlastnosti, jako tsitogibridov, Analýza oddělování rodičovských chromozomů a hodnoceny pluripotenci hybridní genom. Pro mezidruhových hybridních buněk produkovaných fúzních teratokarcinomových buněk somatických buněk, obecně vyznačuje nízkou segregaci chromozomů se tetraploidní nebo téměř tetraploidní karyotyp. Podobná chromozomální kompozice byla pozorována u cytohybridu fúzí primárních pohlavních buněk s lymfocyty. Ve stejné době, mezidruhové hybridní buňky získané v důsledku fúze myších lymfocytů buněk teratokartsinomnyh norek, tam byla intenzivní segregaci chromozomů somatická partnerem.

Kvalitativně nová fáze studiu segregace rodičovských chromozómů v mezidruhových hybridů přišel po vývoji mikrosatelitní analytickou metodou za použití polymerázové řetězové reakce, přičemž každý chromozom myši nalezeno několik set značek, což umožňuje spolehlivě rozlišit jakoukoli dvojici homologních chromozomů v hybridních buněk.

Spojením ESK (za použití HM-1 buňky deficitní v gipoksantinfosforiboziltransferazy činnosti, 2n = 40, XY, izolovaný z blastocysty myšího kmene 129 / 01A) se splenocyty z myší kongenní čáry DD / c se nepodařilo přijmout sadu hybridních klonů morfologicky měl podobnost hESCs. Všechny klony byly izolovány na selektivním médiu, ve kterém je možný růst pouze s aktivní buněčnou gipoksantinfosforiboziltransferazoy. Elektroforetická analýza ukázala přítomnost všech klonů alelická varianta gipoksantinfosforiboziltransferazy charakteristika myši DD / c. Pomocí cytogenetické analýzy bylo zjištěno, že čtyři měl tři hybridní klony okolodiploidny sada chromozomů. Jeden téměř tetraploidní klon obsahoval dvě populace hybridních buněk, z nichž jedna byla tetraploidní a druhý, menší - diploidní.

Analýza mikrosatelitních umožňující rozlišit jakoukoli dvojici homologních chromozomů myší 129 / 01A a DD / c, v hybridních klonů se okolodiploidnym sady ukázala, že klony došlo ve dvou různých přednostní odstranění nepohlavních somatické partnera. Většina autosomálně klony HESS2 a HESS3 měl markery linie 129 / 01A, tj pluripotentní partnera. Výjimkou byla chromozomu 1 a I: klony HESS2 a HESS3, spolu s markery HM-1 buněk, malý počet markerů přítomna somatická partnera. Tyto výsledky mohou odrážet neúplné segregaci chromozomů 1 a a somatickou partnera a jsou v souladu s údaji, které cytogenetickými trizomie chromozomů, které se vyskytuje v 30 až 40% HESS2 a buněčné klony HESS3. HESS4 klon lišily významně v chromozomální složení: mnoho autozomy Tento klon pochází z genomu ESK (chromozomy 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 a 17), ale chromozómy 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 a 19 byly prezentovány homologů obou rodičů. Kvantitativní poměr mikrosatelitních markerů tyto homologní chromozómy odpovídal přibližně 1: 1. To umožnilo autorům naznačují, že jeden homolog je odvozena z genomu ESC a druhý - z diferencovaných buněk. V některých subklonů klonu HESS4 pozorovány pouze symbolické přítomnost chromozomů 18 a 19 somatických partnera. Výsledky ukazují, že buňky klonovat HESS4, navíc k segregaci chromozomů somatických partnera, bylo odstranění jedné nebo obou homology výše chromozómu pluripotentní genomu, tedy došlo k oboustranné segregace chromozómů obou rodičů - tento jev je zcela neobvyklé, protože tsitogibridov charakteristická segregace chromozómů jen jeden z rodičů.

Kromě toho, po průchodu 20., všechny klony hybridních buněk obsahují pouze chromozomu X markery somatické partnera, to znamená, že v klonech byl nahrazen X chromozomu ESC na X chromozomu somatické partnera. To je potvrzeno in situ hybridizačními daty za použití FITC-značené sondy specifické pro myší chromozom X: pozitivní signál byl detekován pouze na jednom chromozomu. Všimněte si, že v předchozích načasování kultivace (do 15. Pasáž) podle cytogenetických dat, které jsou dva X chromozómy v mnoha buňkách. V důsledku toho je použití selektivních médií umožňuje manipulovat s chromozomální složení hybridní buňky a zaměřen na výběr klonů nesoucích jediný chromozomů somatické partnerské HSR v pozadí genomu.

Jako unikátní vlastnost genomu tsitogibridov je lokalizační rodičovských genomů v jediné jádro, samozřejmě, vyvolává otázku zachování vlastností pluripotentních embryonálních genomu HSV-hybridů somatických buněk v podmínkách těsného kontaktu s genomu diferencovaných buněk. Morfologicky cytohybrid ESC a somatických buněk připomínal rodičovskou linii ESC. Kvalifikace pluripotence ukázaly, že všechny klony okolodiploidnym sadu chromozomů byly schopné tvořit v suspenzní kultuře embryoidních tělísek, ve kterém deriváty tří zárodečných vrstev přítomen.

Většina hybridních buněk obsahovala antigen ECMA-7, marker charakteristický pro rané myší embrya a také měl vysokou aktivitu alkalické fosfatázy. Nejvíce přesvědčivé údaje o vysokých pluripotentních vlastnostech hybridních buněk byly získány v experimentech za účelem získání řady injekčních chimér zahrnujících hybridní buňky klonu HESS2. Analýza biochemických markerů ukázala, že potomky dárcovských hybridních buněk byly nalezeny ve většině chimérních tkání. V důsledku toho, že hybridní buňky získané fúzí a HSR diferencované somatické buňky udržet pluripotenci na vysoké úrovni, včetně schopnosti, když se zavádí do dutiny blastocysty pro vytvoření chiméry.

Klony HESS2 a HESS4 se významně lišily ve složení mateřských chromozomů, ale měly podobné pluripotentní vlastnosti. Dalo by se předpokládat, že plyuripotentnostv ‚in hybridního genomu se projevuje jako dominantní znak, ale je možné, že ne všechny embryonálních genomu chromozomů se podílí na udržování pluripotence. Pokud je tento předpoklad je pravda, že lze očekávat, že odstranění některých chromozomů pluripotentní partnera z genomu hybridních buněk není doprovázena změnou jejich pluripotentní stavu. V tomto případě, analýza segregace rodičovského chromosomu v embryonálních hybridních buněk by umožnila, aby se v blízkosti k identifikaci chromozomů odpovědné za řízení pluripotenci embryonálních buněk.

Serov O. Et al (2001) zjistili, mezi 50 potomstva získaného křížením chimér s normální myši, které se mají genotyp myší 129 / 01A, a nesoucí X chromozomu DD myší. Autoři vidí důvod pro snížení počtu pluripotencií v hybridních buňkách pod vlivem somatického genomu. Alternativní vysvětlení může být negativní vliv trizomie nějakou nerovnováhou autozomů a pohlavních chromozomů (XXY pozorována v buňkách až do 15. Pasáž) v hybridních buňkách při průchodu meiózy. Je známo, že buňky XXY nemohou projít meiosou a vytvářet gamety. Trizomie je také schopen způsobit snížení proliferační aktivitu hybridních buněk, což má za následek selektivní výhodu ve vývoji chimér může patřit do buněk příjemce embrya. Z toho vyplývá, že pro dostatečné vyhodnocení pluripotentního potenciálu hybridních buněk je nezbytné získat hybridní klony s normální diploidní sadou chromozomů.

V pokusech Serova O. Et al (2001), první demonstruje možnost přeprogramování chromozom X v genomu somatických buněk hybridní buňky. Tento závěr vyplývá z autoři analýzu exprese chimér HPRT genu (X-chromozóm značka): přítomnost alelických variant HPRT DD / c myší byla detekována ve všech analyzovaných tkáních chimérická. Je třeba zdůraznit, že po zavedení hybridních buněk v blastocysty dutině tsitogibridy spadají do neselektivních podmínek a zachování X chromozomu v genomu hybridních buněk, znamená, že se stal obligátní součást svého genomu a nemá to nediskriminuje z Y chromozom pluripotentní partnera.

Shrnuje výsledky analýzy interakce somatické a pluripotentních genomu v hybridních buněk, autoři došli k závěru, že v některých tsitogibridah pluripotenci se jeví jako dominantní znak. Hybridní gen schopný jednotlivých chromozomů přeprogramovat diferencované buňky, které se však nevylučuje opačný účinek na somatické genomu pluripotenci embryonálního genomu. Při kultivaci hybridních buněk dochází k indukci diferenciace mnohem častěji než v původní mateřské řadě ESC NM-1. Podobný účinek je také pozorován při tvorbě primárních kolonií: mnoho primárních kolonií embryonálních hybridních buněk se v počátečních stádiích rozlišuje s velkými ztrátami klonů během jejich výběru a násobení.

Takže cytohybridy vytvořené fúzí ESC se somatickými buňkami, i přes blízký kontakt s genomem diferencovaných buněk, zachovávají pluripotenci jako jedinečnou vlastnost embryonálního genomu. Navíc v takových hybridních buňkách je možné reprogramovat jednotlivé chromozomy pocházející z difuzovaných buněk. Zůstává nejasné, jak dobře zachována plyu- ripotentnye vlastnosti embryonální genomu v hybridních buněk, zejména jejich schopnost podílet se na tvorbě zárodečné linii chimér. K tomu je nutné získat embryonální hybridní buňky s normálním karyotypem. V každém případě, pluripotentní embryonální hybridní buňky může být reálný model pro genetické identifikace chromozomů podílejících se na udržování pluripotence nebo její kontroly jako bilaterální segregace rodičovských chromozomů potenciálně poskytuje takovou možnost.

Ne méně atraktivní je studium fenoménu, který O. Serov a spoluautoři (2001) definují jako "chromozomální paměť". V hybridním genomu homologní chromozómy jsou dvě alternativní konfigurace: homology somatické partnera jednou prošla diferenciace, vzhledem k tomu, homology pluripotentní partnera, tento proces teprve začíná. Z tohoto důvodu zachování vysoké pluripotentní vlastnosti hybridních buněk, naznačuje, že „pluripotentní“ konfigurace homology ESC poměrně stabilní v hybridních genomů, navzdory dopadu transdeystvuyuschih faktorů vycházejících z somatické partnera. Výše popsané vlastnosti přeprogramování diferencované homologní genomu chromozomů během vývoje chimér nevylučují možnost, že první fáze tvorby in vitro a kultivace tsitogibridov které si zachovávají svou získané během diferenciace in vivo. Podle posledních údajů, při přenášení embryonálních hybridních buněk v neselektivním médiu, ve kterém dochází k intenzivní pouze eliminační chromozomy somatické partner, to znamená, že genom hybridních buněk snadno rozliší homology po kultuře in vitro po dobu 10-15 pasáží. Tak, embryonální hybridní buňky představují slibnou experimentální model pro studium nejen ze základních vlastností embryonální genomu jako pluripotenci, ale také na jeho alternativy - embryonální diferenciaci.

Terapeutická účinnost transplantace embryonálních kmenových buněk

Před analýzou terapeutické účinnosti transplantace ESC a jejích derivátů shrnujeme výše uvedený materiál. Funkce ESC, pokud jde o plné provedení embryogeneze in vitro jsou nedostatečné, protože vady v tomto případě z důvodu nepřítomnosti mesenchymálních kmenových buněk, které se vyskytují v těle samostatně a nezávisle na hESCs. Genetická účinnost ESC je menší než genetický potenciál zygoty, a proto se přímo nepoužívá pro klonování embryí. Jedinečný biologický potenciál ESC jako jediných buněk, ve kterých jsou vývojové programy rozmístěny v úplné sekvenční implementaci, se uplatňuje ve studiích o funkci genů. Použití ESK provádí dekódování první kombinace signálů, které aktivují expresi časných a pozdních genů, kódující pro rozvoj tří zárodečných vrstev. Zachování genomu pluripotenci HSR in vitro činí je unikátní nástroj pro opravy regenerace, který může automaticky kompenzovat ztráty buněk poškozených orgánů a tkání. V ideálním hypotetické provedení lze předpokládat, že „... V transplantaci dárce PGC v organismu příjemce, jsou přeneseny kompaktně zabaleny programy, které za příznivých podmínek jsou realizovány ve výstavbě nových tkani'7 schopného“ ... Efektivně integrovat do těla příjemce jako morfologické, funkční i funkční. "

Přirozeně, po vývoji metod pro monodiferenciaci ESC, začalo in vivo studium funkční aktivity buněk získaných in vitro z jediného specializovaného klonu. Proliferující ESO klon generuje populace migrujících progenitorových buněk, které jsou skutečně schopné aktivně integrovat do oblastí poškození tkání příjemce, které se používají v regenerativní plastické medicíně. Bylo zjištěno, že transplantace dopa-neuronů v substantia nigra snižuje klinické projevy v experimentálním hemiparkinsonismu. Regionální transplantace donorových neurálních kmenových buněk snižují míru motorických poruch způsobených traumatem nebo kontusí míchy a mozku. Získané a první pozitivní výsledky transplantace kmenových buněk u demyelinizačních onemocnění. Zdá se, že regenerační-plastové síly ESC otevřou neomezené možnosti využití buněčné transplantace v praktické medicíně. Při transplantaci do ektopických zón se však ESC nevyhnutelně přeměňují na nádory. Při subkutánní injekci ESC v imunodeficientních myších se tvoří teratomy. Když se suspenze ESK transplantuje pod tobolku testis u syngenních myší, vytváří se také teratom, tvořený různými tkáněmi, jejichž buňky jsou odvozeny ze všech tří embryonálních letáků. U takových teratomů jsou procesy snížené organogeneze extrémně vzácné.

V řadě studií poskytují informace o pozitivních výsledků časné deriváty transplantaci ESC zvířat s experimentálně ex-patologie. Cell neurotransplantation za použití derivátů PGC je dále vyvinut v experimentu a prvních klinických zkoušek při korekci funkčních poruch v mozku a míchy, ošetření syringomyelie a roztroušená skleróza (Repin, 2001). S příchodem technologie neyronogeneza HSR in vitro, namísto použití transplantace techniky embryonální mozkové tkáně vyvinuty deriváty neurosféry, získané z kultur embryonální nervové tkáně. Takové transplantační suspenze jsou mnohem homogenní a obsahují spáchané neuronové a neurogliové prekurzory.

Navíc k normálnímu kultivačnímu médiu kyselinou retinovou v dávce 10 ug / ml po dobu 6 týdnů v embryonálních linií (teratomy) NTERA-2 lidského -kartsinomy tvořen více než 80% z post-mitotických neuronů. Kompletní homogenita neuronovou populací je dosaženo průtoku třídění značené immunophenotypic markery zralých neuronů, které mohou zbavit zbytků teratokartsinomnyh a nezralých buněk. Po transplantaci do různých oblastí mozku experimentálních zvířat neurony nejen přežívají, ale jsou také vestavěny do regionálních neuronových sítí. U zvířat se experimentálních modelů lokálních poruch CNS neurotransplantation snižuje klinické projevy lidskou patologií, jako jsou účinky kraniocerebrální trauma, mrtvice, demyelinizační onemocnění, vrozených vad cerebelární vývoj, onemocnění ukládání lipidů a polysacharidů.

Pro optimalizaci regeneračních procesů u degenerativních onemocnění centrálního nervového systému se vyvíjejí technologie pro přípravu oligodendrocytů produkujících myelin z ESK. První fáze tradičně zahrnuje proliferaci ESC s násobením počtu buněk nezbytných pro transplantaci. Ve druhém stupni je prováděna řízená diferenciace buněk do populace prekurzorů oligodendrocytů produkujících myelin, která je řízena selektivními markerovými antigeny.

Některé vyhlídky jsou otevřeny pro použití s deriváty HSR vyvinout metody pro korekci imunodeficitu způsobeného genetické vady v zrání brzlíku. Ve studiích na knockout (RAG 1) myši s indukovanou defektem genu - porušení rekombinace mechanismus V (D) J místa genu TCR, což vede ke ztrátě funkce T-lymfocytů, transplantace časné deriváty PGC v brzlíku zvíře zotaví zrání normální populace imunitních klonů odpovědných za buněčná imunita. Klinické studie transplantace předem připravené in vitro hESCs k léčbě fatální dědičné anémie u dětí.

Námitky k rychlému zavedení transplantace kmenových buněk na klinice jsou odůvodněny omezený počet stabilních linií lidských embryonálních kmenových buněk a potřebu normalizace. Pro zvýšení čistoty standardizovaných ESC linek a dospělých kmenových buněk se navrhuje použít metodu pro výběr řádků na základě molekulárně genetické analýzy DNA repetic krátké tandemové. Nutné je také kontrolována ESC linky na přítomnost malých chromozomálních aberací a genetických mutací, potenciál pro jejichž výskyt za podmínek buněčné kultivace, je poměrně velká. Práce rozšiřuje povinné zkoušení vlastností všech typech PGC a regionálních pluripotentních kmenových buněk, protože jejich množení in vitro může vést k novým vlastnostem není spojených embryonálních kmenových buněk na definitivní nebo tkání. Zejména se předpokládá, že dlouhodobá kultivace v médiu s cytokiny Hess blíže k nádorovým buňkám, protože se vyskytují podobné změny drah regulujících buněčný cyklus s pořízením schopnost provádět neomezený počet buněčných dělení. Někteří autoři, na základě potenciálu vývoje nádorů, považují transplantaci prvotních derivátů embryonálních kmenových buněk za bezohlednost. Podle jejich názoru je mnohem bezpečnější používat oddaných potomků ESC, tedy linie předků diferencovaných buněk. Nicméně spolehlivá technika pro získání stabilních lidských buněčných linií, které se liší správným směrem, dosud nebyla vyvinuta.

V literatuře je tedy stále více údajů o pozitivním terapeutickém účinku transplantace derivátů lidských embryonálních kmenových buněk. Mnohé z těchto děl však podléhají revizi a kritice. Někteří vědci se domnívají, že výsledky raných klinických studií mají předběžnou povahu a naznačují pouze to, že kmenové buňky mohou mít příznivý účinek na klinický průběh onemocnění. Proto je nutné získat údaje o dlouhodobých výsledcích transplantace buněk. Jako argument jsou uvedeny fáze vývoje klinické neurotransplantologie. Ve skutečnosti, v literatuře, původně ovládána zveřejnění vysoké účinnosti transplantace mozku fragmenty embryí u Parkinsonovy choroby, ale pak se začaly objevovat zprávy popírají terapeutickou účinnost embryonální nebo fetální nervové tkáně transplantované do mozku pacientů.

Řídil první klinické testy hodnocení bezpečnosti transplantace neuroblast - deriváty PGC NTERA-2 teratokarcinomu, nezralé buňky, které proliferují v kultuře byly podrobeny skladování 100 miliontý buněčné hmoty. Část takto získaných buněk byla použita pro určení charakteristik fenotypu buňky a nečistot, jakož i pro testování potenciální kontaminace viry a bakteriemi. Z kultivační médium bylo odstraněno a LIF živné vrstvě buněk stromatu a fetálních vytvořeny podmínky pro řízené diferenciaci hESCs do Neuroblasty s kombinací cytokinů a růstových faktorů. Pak se čistí z nezralých Neuroblasty teratokarcinomových buněk pomocí průtoku pro třídění buněk. Po druhém čištění a charakterizace fenotypu transplantovaných buněk Neuroblasty (10-12000000), suspenze pomocí speciální injekční stříkačky, a microcannulas stereotaxy a pod kontrolou CT vstřikován do nucleus basalis mozku pacientů (sedmý měsíc po hemoragické mrtvici). Odnogodovoy po transplantaci screening účinky transplantaci neuronů v zdvihu zóně viditelné žádné nežádoucí a nežádoucí účinky. U poloviny pacientů došlo ke zlepšení motorické funkce v období od 6 do 12 měsíců po transplantaci. Pozitivní klinické změny byly doprovázeny zvýšením prokrvení zdvihu zóně po transplantaci buněk: průměrné zvýšení absorpce fluorescenčního značených 2-deoxyglukózy, podle pozitronová emisní tomografie dosáhl 18%, a v některých pacientů - 35%.

Americký národní ústav zdravotnictví však provedl nezávislou studii o klinické účinnosti neurotransplantace u pacientů s parkinsonismem. Pacienti v první skupině byli transplanted embryonálními nervovými tkáněmi produkujícími dopamin, zatímco druhá skupina pacientů podstoupila falešnou operaci. Výsledky ukazují nulovou klinickou účinnost takové neurotransplantace, a to navzdory skutečnosti, že embryonální neurony produkující dopaminy přežily v mozku příjemců. Navíc po 2 roky po transplantaci fetální nervové tkáně u 15% pacientů došlo k rozvoji trvalé dyskineze, které chybí u pacientů ve skupině s placebem (Kmenové buňky: vědecký pokrok a budoucí výzkumné směry Nat Inst ve zdravotnictví USA ...). Pozorování dalšího vývoje onemocnění u těchto pacientů pokračuje.

Někteří autoři přisuzují rozporuplný literaturu o hodnocení klinických údajů účinnost Neurotransplantation s odlišným přístupem k výběru pacientů skupin, neadekvátní výběr objektivní metody hodnocení jejich stavu a, co je nejdůležitější, různé podmínky vývoje plodu nervové tkáně a v různých částech mozku, ze kterého byla textilie, vyrobené v různých velikostech transplantace a metodické rysy chirurgie.

Je třeba poznamenat, že pokusy o přímé transplantaci pluripotentních embryonálních kmenových buněk do striatální oblasti mozku krys s experimentálním těla gemiparkinsonizmom doprovázena proliferaci ESC a jejich diferenciaci na dopaminergní neurony. Je třeba předpokládat, že nově vzniklé neurony účinně zabudován do neuronové sítě, jako regulátory otáček po transplantaci byla pozorována korekce anomálií chování a motoru asymetrie v apomorfinu testu. Současně některé z zvířat zemřely kvůli transformaci transplantovaného ESK v nádoru mozku.

Odborníci z amerického Národního a lékařské akademie, specialisté National Institutes of Health se domnívají, že klinický potenciál hESCs si zasluhuje velkou pozornost, ale trvají na tom, že je třeba pro detailní studium jejich vlastností, nebezpečí komplikací a dlouhodobé účinky při pokusech s odpovídajícími biologických modelů lidských nemocí (Kmenové buňky a budoucí regenerační medicína Národní akademický tisk, kmenové buňky a budoucí výzkumné směry., Nat. Inst, Health USA).

Z tohoto hlediska je důležité, že srovnávací Histologická analýza experimentálních teratom získaný transplantací ve varlatech kalové PGC s teratomů, které se vyvinuly v důsledku transplantace časné embryo, které zahrnovaly také přítomny HSV ukázal, že ESK bez ohledu na původ nebo interakce s jedna nebo jiné okolní buňky stejným způsobem realizovat jejich tumorigenní účinnost. Ukázalo se, že takové teratomů klonální původ, jako z nádoru HSR může dojít, skládající se z derivátů všech tří zárodečných vrstev (.Rega, 2001). Je pozoruhodné, že když transplantovány do imunodeficientních myší klonovaných PGC s normálním karyotypem a vytvořených teratomů sestávajících z různých typů diferencovaných somatických buněk. Tyto experimentální údaje - perfektní důkaz klonální původ teratomů. Z pohledu vývojové biologie, které naznačují, že to není násobkem angažovaných progenitorových buněk a pluripotentních kmenových buněk identity je zdrojem diferencovaných derivátů všech tří zárodečných vrstev, teratom komponent. Nicméně, v praktické výsledky transplantace buněk těchto studií jsou, pokud nejsou příliš vysoké, pak se varovný signál potenciální nebezpečí, protože inokulační ESC nebo primordiálních zárodečných buněk v různých tkáních dospělých imunodeficientních myší nevyhnutelně způsobí vývoj nádoru z transplantovaných kmenových buněk. Neoplastická degenerace ektopicky transplantují ESC doprovázené vznikem satelitních populace diferencovaných buněk - částečně odlišit je jistě HSR a progenitorové klony vyhrazené linky. Je zajímavé, že po transplantaci hESCs do buněk kosterního svalstva u teratokartsinomnymi neuronů tvoří častěji. Nicméně, v spravujících PGC Mace vejce nebo blastocysty doprovázeno úplné integrace do zárodečných buněk bez tvorby nádorových buněk. Zároveň ESC vložený téměř ve všech orgánech a tkáních embrya, včetně sexuálního zárodek. Takové allofennye zvířata byla nejprve připraví zpracováním teratokarcinom buňky 129 v časných stádiích embryí u 8-100 buněk. V allofennyh populace myších jsou geterogenomnyh dárce PGC buněk odvozených z zavedeny do kostní dřeně, střev, kůže, jater a pohlavních orgánů, které umožňuje vytvářet v experimentu i mezidruhové buněčné chimér. Čím menší je doba časného embrya, tím vyšší je procento buněk chimerization, nejvyšší stupeň chimerization pozorované v hematopoetického systému, kůže, nervového systému, jater a tenkého střeva allofennogo embrya. V dospělém organismu tkáň přístupný chimerization chránit před imunitním systémem příjemce gistogematicalkie překážky: transplantace primordiální zárodečné buňky ve varlatech parenchymu doprovázené vložením dárce kmenových buněk do tkáně příjemce germenativny vrstvy. Nicméně, nedochází transplantace ESC do útvaru blastocysty chimérických primordií genitálií generace dárcovských primordiální zárodečné buňky. ESC pluripotence při vytváření zvláštních podmínek, a mohou být použity pro klonování: ESC transplantace myší 8-16 buněk myšího embrya, buněčné mitózy kde tsitokalazinom blokované, přispívá k normálnímu embryogeneze se vývoje embrya dárcovských PGC.

V důsledku toho, lze místo transplantace alogenní ESC terapeutického klonování založené na jádra somatické buňky transplantaci do enukleovaného oocytu vytvořit blastocysty vnitřní buněčné hmoty, ze které se pak přidělenou linie geneticky identických dárcovských PGC somatická jádra. Technicky je tato myšlenka je možné, protože možnost vytvoření lidských embryonálních kmenových buněk linií z blastocysty získané po transplantaci somatických jader do enukleovaného vajíčka opakovaně ukázal v pokusech na laboratorních zvířatech (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Zejména u myší homozygotních pro mutace rag2, fibroblasty získané kultivací tkáňové buňky subepidermální byly použity jako dárců jádra se přesadí do enukleovaných oocytů. Po aktivaci oocytů „zygota“ kultivovány, dokud nebyl vznik blastocysty, z vnitřní buněčné hmoty se izoluje PGC a předávání je do linky pro mutantní gen nullizigotnyh buněk (rag2 ~ / ~). Homologní rekombinaci v těchto ESC byla opravena mutace jednoho alelického genu. V první sérii pokusů z hESCs rekombinantní gen získán embryoidních tělísek byly připraveny, transfektované buňky jejich rekombinantní retrovirus (HoxB4i / GFP) a po množení u myší injekcí žíly rag2 ~ / ~. Ve druhé sérii byly tetraploidní blastomery agregovány s geneticky modifikovanými ESC a transplantovány jejich ženským příjemcům. Narozené imunokompetentní myši sloužily jako donory kostní dřeně k transplantaci do mutantních myší rag2 ~ / ~. V obou sériích, výsledek byl pozitivní: 3-4 týdnů ve všech myší normálních zralých myeloidních a lymfoidních buněk bylo zjištěno, schopné produkovat imunoglobuliny. Tak, transplantace do oocytu jader somatických buněk, mohou být použity nejen k produkci lidských embryonálních kmenových buněk linie, ale také pro tsitogenoterapii - oprava dědičných abnormalit ESC jako vektor pro přepravu korekci genetické informace. Ale v tomto směru transplantace buněk existují kromě bioetických problémů také omezení. Není jasné, do jaké míry je transplantace bude terapeuticky klonován buněk s genotypem totožné s genotypu konkrétního pacienta, protože tyto buňky se mohou zavést mutace, které vytváří predispozici k určitým onemocněním. Normální lidská vajíčka zůstávají nepřístupné objekt, přičemž i při transplantaci somatických jádra do enukleovaného zvířecího vajíčka pouze 15-25% inženýrstvím „zygota“ vyvinout do stádia blastocysty. Není určeno, kolik blastocysty je potřebné k získání jediné linie pluripotentních klonovaných ESC. Je třeba poznamenat i vysokou úroveň finančních nákladů spojených se složitostí metodologie terapeutického klonování.

Závěrem, v pluripotentním genomu ESC hypomethylated DNA v kombinaci s vysokou telomerasové aktivity a krátké fázi C ^ buněčného cyklu, což zajišťuje intenzivní a potenciálně nekonečnou násobení, během které PGC udržet diploidní chromozomů a „juvenilní“ sadu fenotypových charakteristik. Klonální růst PGC v kultuře nebrání jejich diferenciaci na každém specializované buňky organismu na proliferaci a zastavení linky a přidáním odpovídající regulační signály. Omezení diferenciace hESCs v souladu in vitro somatické buňky je realizována bez účasti mesenchymu, obcházet Nohteyaov, je organogeneze a bez tvorby embrya. Ektopická v PGC vivo podávání nevyhnutelně vede k tvorbě teratokarcinomu. Transplantace ESC do blastocysty nebo začátkem embrya doprovázené jejich integrace s tkáněmi embrya a jeho stabilní chimerization orgánů.

Regenerační a plastové technologie založené na transplantaci buněk je průsečík zájmů členů buněčné biologie, vývojová biologie, experimentální genetika, imunologie, neurologie, kardiologie, hematologie a mnoha dalších oborech experimentální a praktické medicíně. Nejdůležitější experimentální výsledky potvrzují možnost přeprogramování kmenové buňky se směrem změny jejich vlastností, které se otevírá vyhlídky pro řízení buněčně diferenciační procesy, růstovými faktory - infarktu regeneraci, obnově léze CNS a normalizaci funkce přístroje ostrůvků slinivky břišní. Nicméně, rozšířené transplantaci zavedení Deriváty ESC v lékařské praxi je nutné zkoumat vlastnosti lidských kmenových buněk podrobněji a další experimenty s PGC v experimentálních modelech onemocnění.

Bioetické otázky a problém odmítání alogenní transplantace buněk by mohla vyřešit pozorovanou plasticitu genomu regionálních dospělými kmenovými buňkami. Nicméně počáteční informací je, že při přesazování játrech izolované a důkladně charakterizovaných autologních hematopoetických buněk, z nichž jsou k dispozici nové hepatocyty, které zahrnují do jaterních lalůčků, jsou nyní přezkoumávány a posoudil. Nicméně, zveřejněné údaje, že transplantace neurálních kmenových buněk v brzlíku je tvorba nových výhonků dárcovských T-A a B-lymfocytů, a transplantaci neurální kmenové buňky mozku v kostní dřeni vede k tvorbě hematopoetických zárodečných utrpěl dárců myeloidní a erytropoézu , V důsledku toho, v dospělých orgánech může být zachována pluripotentní kmenové buňky, které jsou schopny genomu přeprogramování ESC do kapacity.

Zdroj HSR pro lékařské využití zůstává lidské embryo, což předurčuje nevyhnutelnost nového přechodu z morálních, etických, morálních, právních a náboženských záležitostí na počátku lidského života. Objev ESC dal silný podnět k obnovení drsných diskusí o tom, kde leží linka mezi živými buňkami a hmotou, substancí a osobností. Současně neexistují univerzální normy, pravidla a zákony týkající se používání ESC v medicíně, a to navzdory opakovaným pokusům o jejich vytvoření a přijetí. Každý stát v rámci svých právních předpisů řeší tento problém sám o sobě. Pro jejich část, lékaři po celém světě i nadále snažit, aby regenerativní lékařství, plast za takových diskusí, a to především díky použití jiných než embryonálních kmenových buněk a kmenových buněk dospělých rezervy.

Některé z dějin embryonální izolace kmenových buněk

Terato- (embryonální) buňky byly izolovány z -kartsinomnye spontánně se vyskytujících varlat kmen teratomy myš 129 / terc-Sv, spontánní ovariální teratomy myší linie Lt / Sv, a z teratomů ektopichno zdroj byly transplantovány buňky nebo embryonální tkáně. Mezi takto získaných terato- stabilních myších linií (embryonálních) -kartsinomnyh některých buňkách jsou pluripotentní, ostatní byly podrobeny diferenciaci pouze v buňkách jednoho konkrétního typu, a některé byly obecně neschopný cytodiferenciační.

V té době byl kladen důraz výzkum, který ukázal možný návrat terato- (embryo) -kartsinomnyh buněk na normální fenotyp po jejich zavedení do tkáně vyvíjejícího se embrya, stejně jako práce k vytvoření in vitro geneticky modifikované terato- (embryo) -kartsinomnyh buňky, pomocí kterých byly myší mutantů získány pro biologické modelování lidské dědičné patologie.

K izolaci terato- linky (embryo) byl použit v klimatizačním -kartsinomnyh buněčné suspenzní kultury. V kultivačním terato- (embryo) -kartsinomnye buněk, jako HSR, růst pro vytvoření embryoidních tělísek a vyžadují být přeloženy do řady vazebné disociační udržování pluripotence v živné vrstvě embryonálních fibroblastech nebo suspenzní kultivace v kondicionovaných médiích. Terato- pluripotentní buňky (embryo) - karcinom linky velké, kulovité, mají vysokou aktivitu alkalické fosfatázy, tvořit agregáty a jsou schopny vícesměrové diferenciace. Když je zaveden do blastocysty jsou začleněny morulae, což vede k vytvoření chimérických embryí, v různých orgánech a tkáních, které jsou deriváty nacházejí terato- (embryo) -kartsinomnyh buňky. Nicméně, drtivá většina takových chimérických embryí umírají v děloze, a v orgánech, přežívající chiméry novorozená cizí buňky a zřídka detekovány s nízkou hustotou. Zároveň výskyt nádorů (fibrosarkom, rhabdomyosarkom, a jiných typů zhoubného otok a adenomu slinivky břišní) se prudce zvyšuje, a nádorových degenerace často dochází i v děloze chimérických embryí.

Většina buněk terato-embryo-karcinomu v mikroprostředí normálních embryonálních buněk téměř přirozeně získává zhoubné neoplastické vlastnosti. Předpokládá se, že nevratná malignita je způsobena aktivací protoonkogenů v procesu strukturálních přesunů. Jedinou výjimkou jsou buněčné linie embriokartsinomnoy sst3, teratom odvozený z myší varlete (linie 129 / Sv-ter), které vykazují vysokou schopnost začlenit se do tkání a orgánů plodu bez následné tvorby nádorů u chimérických myší. Deriváty terato-embryo-karcinomových buněčných linií u chimérních myší prakticky nepodílí na tvorbě primárních gonocytů. Je zřejmé, že je spojena s vysokou frekvencí chromozomálních aberací společné pro většinu terato- (embryo) -kartsinomnyh linie, při kterém buňky pozorované aneuploidie nebo chromozomální anomálii.

Se několik stabilních terato- linky (embryonální) -kartsinomnyh lidských buněk byl připraven v laboratorních podmínkách, vyznačující se tím pluripotenci, vysoký proliferační aktivitu a schopnost diferenciace v kultuře v průběhu růstu. Konkrétně, linie lidských terato-embryo-karcinomových buněk NTERA-2 byla použita ke studiu mechanismů neurální cytodiferenciace. Po transplantaci buněk této linie do subventrikulární oblasti předního mozku novorozených potkanů byla pozorována jejich migrace a neuronogeneze. Objevily se i pokusy transplantovat neuronální terato- získané kultivací buněk (embryo) -kartsinomnoy řádek NTERA-2, pro pacienty s tahy, které podle autorů, vedoucích ke klinickému zlepšení onemocnění. V tomto případě nebyly zaznamenány případy malignity transplantovaných buněk terato-embryo-karcinomové linie NTERA-2 u pacientů s mozkovou mrtvicí.

První řádek nediferencovaných pluripotentních kmenových buněk myší na počátku 80. Let minulého století se dostal Evans a Martin, jejich výběrem z vnitřní buněčné masy blastocysty - embryoblast. Izolované linie ESC pro dlouhou dobu uchovávanou pluripotenci a schopnost diferencovat se na různé typy buněk pod vlivem faktorů zvláštního kultivačního média.

Termín „embryonální pluripotentní kmenová buňka“ patří Leroy Stevense, že vyšetřování tabák dehtu dopadu na frekvenci vývoje nádoru upozornil na výskyt spontánních testikulární teratokarcinomu lineárních (129 / objem) myší v kontrolní skupině. Testikulární teratokarcinomu buňky byly charakterizovány vysokou rychlostí proliferace, a v přítomnosti kapaliny, který zůstává v dutině břišní s tvorbou spontánní diferenciace neuronů, keratinocyty, chondrocyty, kardiomyocytů, stejně jako vlasy a kostí, avšak bez uvedení objednané cytoarchitectonics příslušné tkáně. Při sázení v teratokarcinom buněčné kultuře pěstují nepřipojený k substrátu pluripotentních klonů a vytvořené embryoidních tělísek byla potom zastavena a podrobeny spontánního štěpení disorderly diferencovat na neurony, glia, svalových buněk a kardiomyocytů. Stevens zjištěno, že teratokarcinom myší 129 / objem obsahuje méně než 1% buněk, které jsou schopné diferenciace na různých specializovaných somatické linky, a sama o sobě diferenciace závisí na faktorech, které se jich týkají (složení peritoneální tekutina, produkty přidané ke kultuře zralých buněk nebo tkání). Leroy Stevenson předpoklad o přítomnosti mezi teratokarcinomových buněk embryonální progenitorové sexuální zárodečné buňky byl potvrzen: suspenze embryoblast preimplantační embrya buněk dospělých myších tkáních vytvořeného teratokarcinom, a odděleny od nich čistých buněčných linií po intraperitoneálním podání příjemců, se člení na neurony, kardiomyocytů a jiných somatických kletki deriváty všech tří zárodečných vrstev. Při pokusech in vivo transplantace ESK (získaný z embryoblastu ale ne trofoblastu) v myších embryí v různých fázích linie 8-32 blastomera skončila narození chimérického zvířete (bez vzniku nádoru) v orgánech, které detekuje klíčky dárcovské tkáně. Chimérismus byl pozorován i v řadě pohlavních buněk.

Primární progenitorové zárodečné buňky izolované z myšího embrya zárodečné pohlaví, morfologii, imunologické fenotyp a funkční vlastnosti v souladu s hESCs odvozených od teratokarcinomem Stevenson a embryoblastu. V chiméry narozené po podání hESCs do blastocysty, allofenny varhany morfogeneze vyznačující mozaikovou střídavého dárce a příjemce strukturní a funkční jednotky jsou játra, plíce a ledviny. V řadě případů byla pozorována tvorba střevních kryptoch nebo laloků jater, které se skládají současně z buňky příjemce a dárce. Avšak provádění morfogeneze vždy došlo k genetickým programem formuláře, který patřil příjemce a chimérismus byl omezen na buněčné úrovni.

Potom bylo zjištěno, že proliferace hESCs bez cytodiferenciační na feeder mesenchymálních buněk vrstvy odvozený (fetální fibroblasty) se vyskytuje v přítomnosti LIF závazné v selektivním živném médiu, které selektivně poskytují pouze přežití kmenových a progenitorových buněk, zatímco převážná většina specializovaných buněčných elementů umírá. S pomocí těchto technik v roce 1998 James Thomson bylo přiděleno pět imortalizované linie embryonálních kmenových buněk z vnitřní buněčné masy blastocysty osoby. Ten stejný rok, John Gerhart vyvinul metodu izolace nesmrtelné ESC čáry před sexuálním obláčku čtyři až pět týdnů lidských embryí. Vzhledem ke své jedinečné vlastnosti, dva roky později, embryonálních kmenových buněk a kmenových buněk definitivní tkáň začal být použit v praxi regenerativní medicíně a genové terapie.