Kmenové krvetvorné buňky

Hematopoetické kmenové buňky (HSC) jako mesenchymální progenitorové buňky jsou charakterizovány multipotency a vedou k buněčné linie, konečných prvků, které tvoří krevní buňky a některé specializované tkáňové buňky imunitního systému.

Hypotéza o existenci společného předka všech krevních buněk, stejně jako termín „kmenových buněk“, ve vlastnictví A. Maximov (1909) Potenciál tvorba buněčné hmoty z GSK obrovské -. Kmenové buňky kostní dřeně produkovat 10. Den buňky, které tvoří krvinky samotného periférii. Existence krvetvorných kmenových buněk byla založena v roce 1961 v pokusech na obnovu krvetvorby u myší léčených smrtelnou dávku ozáření, který ničí kmenových buněk kostní dřeně. Pos tj transplantace syngenních buněk kostní dřeně tak letálně ozářených zvířat byly zjištěny diskrétní ložiska krvetvorby ve slezině příjemců, jehož zdroj - jednotlivé klonovacích progenitorové buňky.

Poté byla prokázána schopnost hematopoetických kmenových buněk samovolně podporovat, což zajišťuje funkci hematopoézy během ontogeneze. V procesu embryonálního vývoje se HSC vyznačují vysokou migrační aktivitou, která je nezbytná pro jejich migraci do míst hematopoetických orgánů. Tato vlastnost HSC je zachována i v ontogenezi - kvůli jejich konstantní migraci dochází k trvalé obnově skupiny imunokompetentních buněk. Schopnost GSK migrace, pronikání přes hematoencefalickou tkáňové bariéry, implantace růstu tkání a klonovacích poskytly základ pro transplantaci buněk kostní dřeně v řadě onemocnění spojených s poruchami krvetvorným systému.

Jako u všech mobilních zdrojů kmenových, krvetvorné kmenové buňky jsou přítomny ve vašem nika (kostní dřeně) ve velmi malém množství, což vede k určitým obtížím při jejich přidělování. Immunophenotypic lidské HSC jsou charakterizovány jako CD34 + NK buněk schopných migraci do krevního oběhu a kolonizovat orgánů imunitního systému, nebo znovu osídlit stroma kostní dřeně. Je třeba jasně pochopit, že GSK není nejvíce nezralé buňky kostní dřeně, a jsou odvozeny od prekurzorů, které obsahují dormantnye fibroblastových SB34-negativních buněk. Bylo zjištěno, že buňky s fenotypem CD34 jsou schopné vstoupit do krevního řečiště, kde se změní jejich fenotyp v CD34 +, ale zpětná migrace v kostní dřeni pod vlivem mikroprostředí opět stane CD34-negativní kmenových buněk prvky. V klidu CD34-buňky nereagují na parakrinní regulační stromální signály (růstové faktory, cytokiny). Nicméně, v případech, které vyžadují intenzity zesílení krvetvorných kmenových buněk s fenotypem CD34 reagovat na diferenciační signály tvoří oba hematopoetických a mesenchymální progenitorové buňky. Hematopoeza se provádí přímým stykem s GSK buněčných elementů v podpůrné vazivové tkáně kostní dřeně představoval komplexní síť makrofágy, retikulární endoteliální buňky, osteoblasty, stromální fibroblasty a extracelulární matrix. Kostní dřeň stromální rámec - nejen matrice nebo „kostra“ pro krvetvorné tkáně, nese jemné regulace krvetvorby v důsledku parakrinní regulačních signálů, růstových faktorů, cytokinů a chemokinů, a také poskytuje adhezní interakce jsou nezbytné pro tvorbu krevních buněk.

Základem neustále aktualizovaného hemopoetického systému je hemopoetická kmenová buňka, která je schopna dlouhodobé sebeúdržby. Během procesu páchání se HSC podrobí primární diferenciaci a tvoří klony buněk, které se liší jejich cytomorfologickými a imunofenotypickými charakteristikami. Následná tvorba primitivních a spáchaných progenitorových buněk je dokončena tvorbou morfologicky identifikovatelných buněk předků různých hematopoetických linií. Výsledkem následné etapy komplexního vícestupňového způsobu je zrání hematopoetických buněk a získání zralých do periferní krve, vytvořených prvků - erytrocytů, leukocytů, lymfocytů a krevních destiček.

[1], [2], [3], [4], [5]

Zdroje hematopoetických kmenových buněk

Krvetvorné kmenové buňky jsou považovány za nejvíce studovaných kmenových zdroj, který je do značné míry v důsledku jejich použití v klinice transplantace kostní dřeně. Na první pohled je o těchto buňkách známo hodně. Do určité míry je to pravda, protože mezilehlé a zralé potomci GSK - nejdostupnější buněčné elementy, z nichž každý (erytrocyty, leukocyty, lymfocyty, monocyty / makrofágy a krevní destičky) jsou důkladně studovány na všech úrovních - od světla, elektronovou mikroskopii, z biochemické a imunofenotypové vlastnosti před identifikací pomocí analýzy PCR. Sledování však provádí morfologických, ultrastrukturální, biochemických, immunophenotypic a biofyzikálních parametrů genomové GSK nepřineslo odpovědi na mnoho velmi problematické oblasti, se roztok, který je nezbytný pro vývoj transplantace buněk. Stále není stanovena stabilizační mechanismy GSK v nečinném stavu, které jsou aktivovány, na jeviště symetrického nebo nesymetrického dělení, a co je nejdůležitější - věrnosti vzdělání jako funkčně různých krevních buněk, erytrocytů, leukocytů, lymfocytů a krevních destiček.

Přítomnost v buňkách kostní dřeně s fenotypem CD34, které jsou předkové jak mezenchymálních a hematopoetických kmenových buněk vyvolává otázku existence nejbližší blízkosti CD34-negativních buněk v diferenciaci progenitorových buněk a hematopoetických stromální linie. Delší kultivační metoda se získá tzv dlouhodobé kultury „iniciování‚buňky (dlouhodobou kulturu-iniciační buňky - LTC-IC). Životnost takových progenitorových buněk v kolonii tvořících aktivitu stromatu kostní dřeně na základě kombinace růstových faktorů je více než 5 týdnů, zatímco životaschopnost angažovaných jednotek tvořících kolonie (CFU) v kultuře 3 týdnech. V současnosti se předpokládá, že LTC-IC - funkční analog GCW jako repopulyatsionnom při vysokém potenciálu asi 20% LTC-IC jsou charakterizovány fenotypem CD34 + CD38- a vykazují vysokou schopnost sebeobnovy. Takové buňky nalezené v lidské kostní dřeně s frekvencí 1:50 000. Nicméně, je třeba si uvědomit limfoidoinitsiiruyuschie-myeloidních buněk nejblíže HSC, které byly získány za podmínek dlouhodobého (15 týdnů) kultury. Tyto buňky jsou označeny jako LTC, mezi buněk lidské kostní dřeně se nacházejí v 10 krát nižší, než je LTC-IC, a je vytvořen jako myeloidních buněčných linií a lymfoidní krvetvorným stonku.

I když krvetvorné kmenové buňky značení pomocí monoklonálních protilátek, následuje identifikace immunophenotypic je hlavní způsob identifikace a selektivní třídění krvetvorných kmenových buněk s potenciálním klinickým použitím příslušného GSK tak omezené. Blokující protilátky CD34 receptor nebo jiné markerové antigeny během třídění imunopozitivních nevyhnutelně mění vlastnosti buněk, izolované s ním. Výhodnější je imunologicky negativní sekrece HSC na magnetických sloupcích. Nicméně, v tomto případě, třídění se zpravidla používá monoklonální protilátky, které jsou umístěny na nosiči kovu. Také je důležité, že jak způsob přidělování GSK na základě fenotypové, spíše než funkční vlastnosti. Proto mnoho výzkumníků přednost použití analýzy klonogenních parametrů GSK, což umožňuje velikost a složení kolonií pro stanovení stupně zralosti a směru diferenciace progenitorových buněk. Je známo, že v procesu spáchání počet buněk a počet typů v koloniích se snižuje. Hematopoetických kmenových buněk a jejich dceřinná buňka brzy, s názvem „granulocytů erytrocytů monocyty megakariotsitokolonieobrazuyuschaya jednotka“ (SFU-GEMM), vytvoření kultury multilineární velké kolonie, které obsahují, v tomto pořadí, granulocyty, erytrocyty, monocyty a megakaryocytů. Se nachází pod hranicí granulocytární linie závazek monotsitokolonieobrazuyuschaya jednotky (SFU-GM) vytváří kolonie granulocytů a makrofágů, a granulocytové kolonie tvořících jednotek (SFU-G), - pouze malé kolonie zralých granulocytů. Brzy erytrocytů předchůdce - burstoobrazuyuschaya jednotky červených krvinek (SFU-E) - je zdrojem velkých a zralých červených krvinek kolonie tvořící jednotky (SFU-E) - malých červených krvinek kolonií. V obecné populaci, s růstem buněk v polotuhých média lze identifikovat buňky, které tvoří šest typů myeloidních kolonií: SFU-GEMM, GM-SFU, SFU-G, M-SFU, VFU-E a E-SFU).

Kromě hematopoetických derivátů však jakýkoliv zdrojový materiál pro separaci HSC obsahuje významný počet souběžných buněk. V této souvislosti je nezbytné předběžné čištění transplantací aktivních buněk imunitního systému dárce. Obvykle se používá imunosekce založená na expresi specifických antigenů lymfocytů, což umožňuje izolovat a odstranit pomocí monoklonálních protilátek. Kromě toho, technika immunorozetochnaya T-lymfocytů ochuzený transplantaci kostní dřeně, která je založena na tvorbě komplexů CD4 + lymfocytů a specifické monoklonální protilátky účinně odstranit pomocí aferézu. Tato technika poskytuje purifikovaný buněčný materiál s 40-60% hematopoetických kmenových buněk.

Zvýšení počtu progenitorových buněk v důsledku odstranění zralých krevních buněk z leukaferéze výrobku je dosažen protiproudu odstředěním následovaným filtrací (za přítomnosti chelatačního činidla - citrátu trisodného) přes kolonu obsahující nylonová vlákna potažených lidského imunoglobulinu. Důsledná aplikace těchto dvou metod zajišťuje úplné čištění transplantace z krevních destiček, 89% z erytrocytů a 91% od bílých krvinek. V důsledku významného snížení ztrát HSC může být hladina CD34 + buněk v celkové buněčné hmotnosti zvýšena na 50%.

Pro funkční charakteristiky izolovaných hematopoetických kmenových buněk se používá jejich schopnost vytvářet kolonie dospělých krevních prvků v kultuře. Analýza vzniklých kolonií umožňuje identifikovat a kvantifikovat typy progenitorových buněk, stupeň jejich páchání a stanovit směr jejich diferenciace. Klonogenní aktivita se stanovuje v polotuhém prostředí na methylcelulóze, agaru, plazmě nebo fibrinovém gelu, což snižuje migrační aktivitu buněk, což brání jejich uchycení na povrch skla nebo plastu. Za optimálních podmínek kultivace se klony z jedné buňky vyvíjejí během 7-18 dnů. Pokud je v klonu méně než 50 buněk, identifikuje se jako jediný cluster, jestliže počet buněk přesahuje 50 - jako kolonie. Zohledňuje se počet buněk schopných vytvářet kolonii (jednotky tvořící kolonie - CFU nebo buňky tvořící kolonie - COC). Je třeba poznamenat, že parametry a CFU COC nebude odpovídat počtu HSC v suspenzi buněk, i když to koreluje s tím znovu zdůrazňuje potřebu určit aktivitu funkční (tvořících kolonie) na HSC in vitro.

Mezi buňkami kostní dřeně mají hematopoetické kmenové buňky nejvyšší proliferativní potenciál, díky kterému se v kultuře vytvářejí největší kolonie. Podle počtu takových kolonií se navrhuje nepřímo určit počet kmenových buněk. Po vzniku kolonií in vitro více než 0,5 mm v průměru a s počtem buněk, 1000, autoři testovali stabilitu těchto buněk subletální dávky 5-fluoruracilu a zkoumána jejich schopnost znovu osídlit kostní dřeň letálně ozářených zvířat. Podle těchto parametrů se izolované buňky nelišily od HSC a dostaly zkratku HPP-CFC - buňky tvořící kolonie s vysokým proliferativním potenciálem.

Hledá možnost většího kvalitativního výběru hematopoetických kmenových buněk. Nicméně, hematopoetické kmenové buňky jsou morfologicky podobné lymfocyty a jsou relativně uniformní soubor buněk s téměř kulatými jádry, chromatinem a částic slabobazofilnoy malým množstvím cytoplasmy. Přesné číslo je také obtížné určit. Předpokládá se, že GSK v kostní dřeni osoby se vyskytuje s frekvencí 1 na 106 buněk obsahujících jádro.

Identifikace hematopoetických kmenových buněk

Pro zlepšení identifikaci hematopoetických kmenových buněk se provádí postupně nebo současně (na vícekanálovém sorbitanu tere) výzkumu membrannosvyazannyh spektrum antigenů, v němž GSK fenotyp CD34 + CD38 by měly být v kombinaci s nedostatkem diferenciačních markerů lineární, zejména antigeny imunokompetentních buněk, jako jsou CD4, a povrchové imunoglobuliny glycophorin.

Prakticky všechny schémata fenotypizace hematopoetických kmenových buněk zahrnují stanovení antigenu CD34. Tento glykoprotein s molekulovou hmotností asi 110 kDa, nesoucí několik glykosylační místa exprimován na plazmatických buněčné membráně po aktivaci genu lokalizovaným na chromozomu 1. Molekuly CD34 funkce spojena s L-selektinoposredovannym interakcí časných hematopoetických progenitorových buněk z kostní dřeně stromální bázi. Je však třeba mít na paměti, že přítomnost CD34 antigenu na buněčném povrchu umožňuje pouze předběžné posouzení obsahu GSK v buněčné suspenzi, jak je vyjádřena, a jiné hematopoietické progenitorové buňky a stromální buňky kostní dřeně a endotelové buňky.

Během diferenciace hematopoetických progenitorových buněk je exprese CD34 trvale snížena. Erytrocytové, granulocytární a monocytární progenitorové buňky buď slabě exprimují antigen CD34, nebo vůbec na svém povrchu chybí (fenotyp CD34). Na povrchové membráně diferencovaných buněk kostní dřeně a zralých krevních buněk není antigen CD34 detekován.

Je třeba poznamenat, že nejen v dynamice diferenciace krvetvorných progenitorových buněk snižuje hladiny exprese CD34, ale paralelně postupně zvýšenou expresi CD38 antigenu - integrální membránový glykoprotein s molekulovou hmotností 46 kDa, který NAD-glikogidrolaznoy a cyklasy aktivity ADP-ribosyl, což naznačuje jeho účast v transportu a syntéze ADP-ribózy. Existuje tedy možnost dvojí kontroly stupně spáchání hematopoetických progenitorových buněk. Populace buněk s fenotypem CD34 + CD38 +, od 90 do 99% buněk CD34-pozitivní kostní dřeně se skládá z progenitorových buněk s omezenou proliferační potenciál a diferenciace, zatímco s fenotypem CD34 + CD38 buňky mohou nárokovat úlohu GSK.

Ve skutečnosti, populace buněk kostní dřeně, popsaný vzorcem CD34 + CD38-, obsahuje poměrně velké množství primitivních kmenových buněk, které jsou schopné se diferencovat na myeloidní a lymfoidní linie. V souvislosti s dlouhodobou kultivaci s fenotypem CD34 + CD38- buněk podaří získat všechny zralé krevní buňky: neutrofily, eosinofily, basofily, monocyty, megakaryocytů, erytrocyty a lymfocyty.

Relativně nedávno se zjistilo, že CD34-pozitivní buňky exprimují další dvě značky - AC133 a CD90 (Thy-1), které se také používají k identifikaci hematopoetických kmenových buněk. Thy-1 antigen je ko-exprimován s receptorem CD117 (C-kit) na CD34 + buňkách kostní dřeně, šňůry a periferní krve. Tato fosfatidilinozitolsvyazyvayuschy povrchový glykoprotein o molekulové hmotnosti 25-35 kDa, který je zapojen v procesech buněčné adheze. Někteří autoři se domnívají, že antigen Thy-1 je markerem nejvíce nezralých CD34-pozitivních buněk. Replikaci buněk s fenotypem CD34 + Thy-1 + vést k dlouhodobé kultivované linie pro vytvoření dceřinné buňky. Předpokládá se, že antigen Thy-1 blokuje regulační signály, které způsobují rozdělení buněk. Navzdory tomu, že CD34 + TU1 + buňky jsou schopné sebeobnovy a vytvoření dlouhodobého kultivovaných linek, může jejich fenotyp nevztahuje pouze na ochranu zdraví, jak je Thy-1 + obsah v celkové hmotnosti CD34-pozitivních buněčných elementů je asi 50%, pokud překročení počet hematopoetických buněk.

Slibnější pro identifikaci hematopoetických kmenových buněk je AC133, antigenní marker hematopoetických progenitorových buněk, jehož exprese byla nejprve detekována na embryonálních jaterních buňkách. AC133 je transmembránový glykoprotein, který se objevuje na povrchu buněčné membrány v nejranějších stádiích dozrávání GSK - je možné, že i dříve než antigen CD34. Ve studiích A. Petrenka a V. Grishchenka (2003) bylo zjištěno, že AC133 exprimuje až 30% CD34-pozitivních buněk embryonálních jater.

To znamená, že ideální fenotypová profil krvetvorných kmenových buněk dnes pojmy, součet obrysu buňky, v obvodech, které musí být přítomny CD34 antigeny konfiguraci, AC133 a Thy-1, ale neexistuje žádné místo pro molekulární CD38 výstupků, HLA-DR a markery lineární diferenciace GPA , CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20.

GSK fenotypové variace portrét může být kombinací CD34 + CD45RalowCD71low, protože vlastnosti buněk popsaných v tomto vzorci se neliší od funkčních parametrů buněk s fenotypem CD34 + CD38. Kromě toho lidský HSC mohou být identifikovány pomocí fenotypové známky CD34 + Thy-l + CD38Iow / ‚c-kit / nízké - pouze 30 z těchto buněk zcela obnovit krvetvorbu v letálně ozářených myší.

Z analýzy obecných fenotypových charakteristik buněk kostní dřeně ve skutečnosti začala 40 let intenzivního výzkumu GSK současně schopnou jak sebeobnovy a diferenciace do jiných buněčných elementů, což umožňuje odůvodnit použití transplantaci kostní dřeně pro léčení různých patologických stavů krvetvorným systému. Nedávno objevené nové typy kmenových buněk ještě nebyly v klinické praxi široce používány. Nicméně, kmenové buňky z pupeční šňůry (šňůra) krve a fetální játra mohou významně rozšířit transplantaci buněk nejen v hematologii, ale i v jiných oborech medicíny, jak se liší od HSC kostní dřeně jako kvantitativní výkonnostní a kvalitativní charakteristiky.

Objem kmenových buněk hematopoetických buněk potřebných k transplantaci se obvykle získává z kostní dřeně, periferní a pupočníkové krve a také z embryonálních jater. Navíc hematopoetické progenitorové buňky mohou být získány in vitro šířením ESC, následovaným jejich směrovou diferenciací do hematopoetických buněčných elementů. A. Petrenko, V. Grishchenko (2003) správně poukázat na významné rozdíly imunologické vlastnosti a schopnost obnovit krvetvorbu GSK různý původ, nerovný poměr obsažené v jejich zdrojů pluripotentních brzy a později prekurzorů kmenových buněk v důsledku. Kromě toho, krvetvorné kmenové buňky, získané z různých zdrojů dříku, vyznačující se kvantitativně a kvalitativně velmi odlišné sdružení non-hematopoetické buňky.

Tradičním zdrojem hematopoetických kmenových buněk je kostní dřeň. Suspenze buněk kostní dřeně se získává z břišní kosti nebo hrudní kosti lýtkem pod lokální anestezií. Takto získaná suspenze je heterogenní a obsahuje směs HSC, elementů stromálních buněk, spáchaných progenitorových buněk myeloidních a lymfoidních linií a také zralých krevních elementů. Počet buněk s fenotypy CD34 + a CD34 + CD38 mezi mononukleárními buňkami kostní dřeně je 0,5 až 3,6 a 0 až 0,5%. Periferní krev po mobilizaci HSC indukované G-CSF obsahuje 0,4-1,6% CD34 + a 0-0,4% CD34 + CD38.

Vyšší podíl buněk CD34 + CD38 imunofenotypu a CD34 + pupečníkové krve - a 0-0.6 OD-2,6%, a jejich maximální počet je detekován mezi hematopoetických fetálních jaterních buněk - a 2,3 0,2-12,5 -35,8%.

Avšak kvalita materiálu štěpu závisí nejen na množství obsaženého v ní z CD34 + buněk, ale také na jejich funkční aktivitu, která může být odhadnuta na základě úrovně tvorby kolonií in vivo (repopulaci dřeně u letálně ozářených zvířat) a in vitro - růstu kolonií na polotuhých médiích . Bylo zjištěno, že tvořících kolonie a proliferační aktivita krvetvorných progenitorových buněk s fenotypem CD34 + CD38 HLA-DR, izolované z fetálních jater, fetální kostní dřeně a pupečníkové krve, a značně převyšuje proliferační kapacitu hematopoetických buněk tvořících kolonie z kostní dřeně a periferní krve dospělého člověka. Kvantitativní a kvalitativní analýza GSK různého původu byly zjištěny významné rozdíly v jejich relativní obsah v buněčné suspenzi, a funkčnost. Maximální počet buněk CD34 + (24,6%) byl nalezen v transplantačním materiálu získaném z kostní dřeně plodu. Kostní dřeň dospělého člověka obsahuje 2,1% CD34-pozitivních buněčných prvků. Mezi mononukleárních buněk z lidské periferní krve dospělého pouze 0,5% mají fenotyp CD34 +, vzhledem k tomu, pupečníkové krve jejich výše dosahuje 2%. Tak tvořících kolonie schopnost CD34 + buněk z fetální kostní dřeně o 2,7 krát převyšuje kapacitu klonálního růstu krvetvorné kostní dřeně dospělých lidských buněk a pupečníkové krve buňky tvoří podstatně větší kolonií než hematopoetických prvky izolované z periferní krve dospělých: 65,5 až 40 ° C a , 8 kolonií / 105 buněk.

Rozdíly v proliferační aktivitu a schopnosti tvořit kolonie krvetvorných kmenových buněk jsou spojeny nejen s různým stupněm zralosti, ale také s jejich přirozené mikroprostředí. Je známo, že intenzita proliferaci a diferenciaci kmenových buněk rychlostí určenou integrálního regulační vliv vícesložkového systému, růstových faktorů a cytokinů, které jsou vyráběny oběma kmenových buněk a buněčných prvků matice-stromální mikroprostředí. Použití populace purifikovaných buněk a média bez séra s ohledem na buněčné kultuře dává charakterizované růstové faktory, které mají stimulační a inhibiční účinky na kmenových buněk různých úrovních, progenitorových buněk a buněk z spáchaných v určitém lineárním směru. Výsledky těchto studií ukazují, že HSC pocházející ze zdrojů s různými úrovněmi ontogenetického vývoje, liší jak fenotypicky i funkčně. Pro GSK zůstává v raných stádiích ontogeneze, vyznačující se vysokým potenciálem pro sebe-reprodukci a vysokou proliferační aktivitou. Takové buňky se vyznačují delší délkou telomerů a jsou vystaveny tvorbě všech hemopoetických buněčných linií. Reakce imunitního systému na embryonální původ HSC je zpožděna, protože tyto buňky mírně exprimují molekuly HLA. Existuje jasný gradace relativního obsahu HSC a jejich schopnost k self-obnovovat a počet řádků, které tvoří typy závazku: CD34 + buňky plodu játrech> CD34 + buňky z pupečníkové krve> CD34 + buněk z kostní dřeně. Je důležité, aby tyto rozdíly nejsou jedinečné intra- a neo postanatalnomu raném období vývoje člověka, ale i po celé ontogenezi - proliferační a tvořících kolonie aktivita HSC odvozených z kostní dřeně nebo periferní krve dospělého, nepřímo úměrná věku dárce.