Jedna lahvička, dva cíle: Přenosná diagnostika tuberkulózy založená na CRISPR se 100% citlivostí

V časopise Science Advances byl publikován článek o přenosném testu na tuberkulózu, který lze provést přímo ze sputa bez složitého vybavení. Izotermická amplifikace DNA a CRISPR test jsou kombinovány v jedné zkumavce; dva konzervativní inzerční vzorky M. tuberculosis (IS6110 a IS1081) jsou testovány najednou a lidský gen jako interní kontrola vzorku. V malém „slepém“ testu na klinických vzorcích test poskytl 100% citlivost (6/6) a 100% specificitu (7/7) ve srovnání s kulturou; detekční limit je ~69–81 CFU/ml v simulovaném sputu. Výsledek je viditelný na papírovém testovacím proužku a činidla jsou lyofilizována (skladování bez „chladového řetězce“).

Pozadí

Podle WHO zabije tuberkulóza v roce 2023 přibližně 1,25 milionu lidí; tuberkulóza se opět stala hlavní infekční příčinou úmrtí s odhadovanými 10,8 miliony případů. To činí dostupnou a rychlou diagnostiku zásadní, zejména v prostředí s omezenými zdroji.

• Současné testy představují kompromis mezi přesností, rychlostí a cenou. „Zlatý standard“ kultivace je velmi přesný, ale pomalý; mikroskopie je rychlá, ale necitlivá; PCR platformy jako Xpert MTB/RIF Ultra jsou výrazně citlivější (LOD ≈ 15,6 CFU/ml), ale vyžadují drahé vybavení a kazety, což omezuje pokrytí.
• Proč izotermická a CRISPR. Izotermická RPA amplifikace funguje při teplotě 37–42 °C a nevyžaduje termocyklery – pohodlné „v terénu“. Odečítání CRISPR (Cas12/13) přidává druhovou specificitu a umožňuje vizuální laterální tok („strip“) bez složité optiky. Celkově je to cesta k přenosným a levným PVR testům.
• Proč dva cíle MBT najednou (IS6110 + IS1081). IS6110 je vícekopiový insert komplexu M. tuberculosis, ale některé linie mají málo kopií a testy pouze na IS6110 mohou „chybovat“. Přidání druhého insertu IS1081 snižuje riziko falešně negativních výsledků.
• Proč interní lidská kontrola. Vzorky dechu mohou obsahovat inhibitory a „špatné“ vzorky. Endogenní lidská kontrola (např. RNáza P/genomová DNA) potvrzuje, že materiál je adekvátní a reakce není potlačena – jinak nelze výsledek považovat za negativní.
• Formát s jednou nádobou je sám o sobě důležitý. Zkracuje počet kroků, snižuje riziko kontaminace a usnadňuje práci mimo laboratoř. Takové přístupy u TBC již prokázaly životaschopnost; nová práce rozšiřuje tuto myšlenku na formát s dvojitým cílem s interními kontrolami a navíc demonstruje lyofilizaci činidel a čtečku stripů.
• Jaká je hodnota tohoto článku? Autoři prokázali detekci přímo ze sputa po co nejjednodušší přípravě vzorku, detekční limit ~70–80 CFU/ml v simulovaném sputu a 100% citlivost/specificitu na malé zaslepené sadě klinických vzorků – což je dobrá „technologická ukázka“ pro další multicentrické validace.

Jak to funguje

• Vědci zkombinovali RPA (rychlou izotermickou amplifikaci genetického materiálu při 37 °C) s „řezacími“ enzymy Cas13a/Cas12a. Po výběru vodicích RNA nakonfigurovali systém tak, aby cílil na dva cíle MBT současně a paralelně s lidskou DNA (přičemž ověřili, zda je ve vzorku vůbec materiál a zda se reakce „nezastavila“).
• Veškerá chemie se ukládá do jedné zkumavky; po inkubaci se výsledek odečte buď fluorimetrem, nebo na proužku s laterálním průtokem – v podstatě jako expresní test.
• Zpracování sputa bylo zjednodušeno na zahřívání a krátkou centrifugaci – bez extraktorů nukleových kyselin. Pro ty nejomezenější situace autoři dokonce diskutují o manuálních alternativách k centrifugaci.

Co ukázaly testy

• Detekční limit: 69,0 CFU/ml (kmen H37Rv) a 80,5 CFU/ml (BCG) ve „spike“ sputu. Nebyla zjištěna žádná zkřížená reaktivita s jinými bakteriemi/plísněmi.
• Klinické prostředí (zaslepené vzorky): na 13 vzorcích z reálné praxe - 100% senzitivita (6/6) a 100% specificita (7/7) vzhledem k inokulaci. Pro srovnání, na stejné soupravě GeneXpert Ultra vykazoval 100 %/86 %.
• Technické nuance: ze dvou možností odečtu fungoval Cas13a lépe (pro formát „one-pot“ je citlivější než Cas12a). Navíc paralelní testování dvou Mtb cílů snižuje riziko falešných výsledků.

Proč je to nutné?

Dnešní testy jsou kompromisem mezi přesností, rychlostí a dostupností: kultivace je velmi přesná, ale pomalá; stěry jsou rychlé, ale nepřesné; PCR systémy jako GeneXpert jsou přesné a rychlé, ale vyžadují drahé přístroje a kazety. Nový přístup CRISPR si klade za cíl tuto mezeru překlenout: terénní diagnostika, která funguje při 37 °C, s odečty papírových proužků a možností skladování činidel bez chlazení.

Omezení a co bude dál

Toto je časná demonstrace na malé klinické sadě – jsou zapotřebí rozsáhlé, multicentrické testy (včetně koinfekce HIV, u dětí, s paucibacilárními formami a různými liniemi MBT). Autoři samostatně poznamenávají, že v samotné „terénní“ verzi bude nutné stolní centrifugu nahradit plně manuálním řešením. Samotná architektura – „dva cíle + interní kontrola“ v jedné zkumavce – však již prokázala svou provozuschopnost a poskytuje jasnou cestu k zdokonalení pro masové použití.

Zdroj: Alexandra G. Bell a kol. Zjednodušený test založený na CRISPR pro detekci tuberkulózy přímo ze sputa, Science Advances, online 6. srpna 2025 (roč. 11, číslo 32). DOI: 10.1126/sciadv.adx206