Komáři s vestavěným „genetickým štítem“ zastavují malárii – míra infekce klesá o 93 %

Překonání rezistence na insekticidy: Jak se jediná genová modifikace u komárů samovolně šíří napříč generacemi, čímž prakticky eliminuje přenos malárie bez ohrožení přežití.

V nedávno publikované studii v časopise Nature tým vědců zkoumal, zda alela glutaminu 224 (Q224) v proteinu FREP1 (fibrinogen-related protein 1) činí komáry Anopheles stephensi odolnými vůči infekci Plasmodium, odhadl náklady na přežití spojené s touto alelou a testoval systém alelického genového pohonu pro šíření této ochranné mutace v populacích.

Předpoklady

V roce 2023 zemřelo na malárii přibližně 600 000 lidí, většinou dětí v subsaharské Africe a jižní Asii. Tradiční metody kontroly – moskytiéry, insekticidy, antimalarika – ztrácejí svou účinnost kvůli rezistenci komárů a parazitů. Technologie genového řízu, které šíří prospěšné alely prostřednictvím populací komárů, nabízejí slibné a udržitelné řešení.

Protein FREP1 pomáhá parazitům procházet komárovým střevem, ale přirozená varianta Q224 může zabránit infekci, aniž by ohrozila biologii komára. Cílem bylo otestovat, zda by taková endogenní alela mohla být bezpečně distribuována tak, aby se snížil přenos malárie a zároveň se zachovala životaschopnost komára.

O studii

Pomocí CRISPR/Cas9 byly vytvořeny dva kmeny Anopheles stephensi, které se lišily pouze 224. aminokyselinou v proteinu FREP1: divoký typ s leucinem (L224) a potenciálně protektivní kmen s glutaminem (Q224). Vodicí RNA cílila na intronovou oblast 126 bp proti směru transkripce kodonu, což umožnilo homologní rekombinaci s vložením fluorescenční značky (GFP nebo RFP).

Zdatnost byla hodnocena podle délky křídel, plodnosti, líhnivosti vajec, zakuklení, vylézání dospělých jedinců a délky života (Kaplan-Meierova analýza přežití).

Kompetence vektoru byla stanovena pomocí standardního membránového krmení parazitů Plasmodium falciparum (člověk) a Plasmodium berghei (hlodavec) s počtem oocyst a sporozoitů ve slinných žlázách.

Systém alelového řízení zahrnoval kazetu s gRNA proti L224 a Cas9 pod kontrolou promotoru vasa. Frekvence alel byly monitorovány pomocí fluorescenčních značek v multicyklických experimentech (10 generací). Genotypizace byla provedena pomocí PCR, Sangerova sekvenování a NGS. Bayesovské modelování odhadlo konverzi alel, náklady na zdatnost a dynamiku během volného páření v laboratoři.

Výsledky

Alela FREP1Q224 nezpůsobila významné ztráty v přežití: délka křídel, plodnost, líhnutí, kuklení a vylévání dospělých jedinců byly shodné s kontrolní skupinou FREP1L224. Malé rozdíly ve velikosti a délce života samců neovlivnily konkurenceschopnost. Panenské samice FREP1Q224 žily stejně déle jako kontrolní skupina a samice po krmení krví vykazovaly pouze mírné zkrácení délky života.

Výzva k testování odhalila u homozygotů výraznou ochranu.

• Při nízkých koncentracích gametocytů P. falciparum (0,08 %):
  • Míra infekce klesla v FREP1Q224 z 80 % na přibližně 30 %;
  • Průměrný počet oocyst: od 3 do 0;
  • Sporozoity ve slinných žlázách: od >4000 do 0.
• Při vyšší gametocytémii (0,15 %):
  • Průměrný počet oocyst: od ~32 do
  • Sporozoity také dramaticky poklesly.
• Pro P. berghei:
  • Průměrný počet oocyst: od 43 do 25;
  • Sporozoiti: od ~19 000 do 11 000.
• Heterozygoti (FREP1L224/Q224) nebyli chráněni.

Účinnost genového pohonu

• V párových kříženích Cas9 + gRNA L224 přeměnila 50 až 86 % alel FREP1L224 na FREP1Q224;
• U mateřského Cas9 byla frekvence vyšší;
• Ve 2. generaci dosáhla frekvence ochranné alely 93 %;
• Výskyt chyb v opravné dráze NHEJ byl nízký (0–12 %) a obvykle způsoboval poškození.
• V buněčných populacích s poměrem dárce:příjemce 1:3 se frekvence FREP1Q224 zvýšila z 25 % na >90 % během 10 generací;
• Frekvence alel NHEJ klesla z 5,4 % na

Bayesovské modelování podpořilo hypotézu o vysoké konverzi, nízké frekvenci stabilních mutací a efektu letálního sterilního mozaicismu, kdy homozygoti WT s mateřským genotypem Cas9 trpěli somatickými mutacemi a snižovali přežití.

Pozdější generace vykazovaly téměř úplnou supresi oocyst P. falciparum (medián 0 až 5,5), což potvrzuje, že populace se stala do značné míry refrakterní vůči přenosu parazita.

Ochranná alela neměla žádné skryté výhody ani vedlejší účinky a šířila se pudem.

Závěry

Studie zjistila, že nahrazení jediné aminokyseliny v proteinu FREP1 a posun jeho dědičnosti pomocí genového mechanismu by mohl komára Anopheles stephensi učinit prakticky imunním vůči malárii – jak u lidí, tak u hlodavců – aniž by byla ohrožena životaschopnost komárů.

Tento přístup doplňuje stávající opatření (sítě, insekticidy, léky), jejichž účinnost je snížena rezistencí. Takový systém lze také použít k obnovení citlivosti na insekticidy nebo k zavedení dalších ochranných alel.

Než bude možné technologii implementovat, jsou zapotřebí přísné environmentální, etické a správní rámce, jakož i systémy pro kontrolu šíření.