Experimentální práce na transplantaci alogenních keratinocytů na uměle vytvořené jizvy bílých potkanů

Touha využívat buněčný potenciál a potřebu hledání nových účinných metod pro zlepšení estetického vzhledu jizev vedla k myšlence pokusit se studovat možnost transplantace keratinocytů na povrchy jizvy.

Za účelem prokázání možnost použití keratinocytů kultury zlepšit vzhled jizev experimentální práce bylo vykonáno v bílých laboratorních krysách, které byly vytvořeny jizvy povrch. Model bramy krys byl získán v důsledku hojení uměle způsobených ran na zádech podél páteře. Krysy byly nařezané kusy stejné kůže, velikosti 2x3 cm. Po 2,5 měsíců po operaci „simulace jizvením“ u krys byla provedena obroušení pokožky na operaci (odstranění horní vrstvy přes ignioperation bachoru) a transplantovaných alogenních keratinocytů, izolovaný z kůže mladých potkanů 2-4 dny po narození.

Izolace a růst krysích epidermocytů se provádí v laboratoři buněčných technologií Institutu cytologie RAS následující technologie.

Kůže byla promyta v Hankově roztoku chloridu sodného, obsahujícím 200 U / ml gentamicinu, nakrájené na malé kousky, což je oblast 0,2-0,5 cm ². Kostky kůže byly inkubovány v 0,5% roztoku disaspázy ve vyváženém roztoku pufrovaném fosfátem ve fyziologickém roztoku při 37 ° C po dobu jedné hodiny. Kousky byly potom přeneseny do fyziologického roztoku pufrovaného fosforečnanem Dulbecco a epidermis byla oddělena od dermis. Epidermis byl inkubován v 0,125% roztoku trypsinu po dobu 10-15 minut za stálého míchání při rychlosti 50 ot / min, načež se enzym zastavena přídavkem 5% fetálního bovinního séra. Jedna třetina z výsledné buněčné suspenze bylo použito v čisté formě pro jednu z možností, jak transplantaci jizvy, druhý třetí pěstované na domácí biokompatibilní filmového povlaku „Polipor“, třetí - na Petriho misce bez substrátu. Operace dermabraze získaných jizev u potkanů s následnou transplantací krysích epidermocytů na nich byla provedena za anestezie za použití éterické katetry.

První skupina krys po dermabrasion na leštěný, promyje se roztokem chloridu sodného a suší se povrchové sterilní bachoru překrývá kusy trávníku, který byl uložen míchaná alogenní krysí epidermotsitov suspenze v koncentraci 1,5 milionu buněk na 1 ml (v závislosti na Ústavu cytologie). Batistovské kousky se vejdou na leštěnou jizvu tak, aby buňky ležely na povrchu jizev. Obvaz na vrcholu několik vrstev mulu, který je všité do okraje jizvy.

Část výsledné buněčné suspenze byla nanesena do Petriho misky na sterilní Polypore filmy vyřezané ve tvaru pohárků a druhá na Petriho miskách bez filmu. Kultivace se provádí v médiu FAD sestávajícím ze směsi DMEM a F12 v poměru 3: 1. S přídavkem 10% fetálního bovinního séra, 5 ug / ml inzulínu (Sigma), 0,5 ug / ml hemisukcinátu hydrokortizonu (Sigma). 10 μg / ml epidermálního růstového faktoru EGF (Ústav cytologie RAS, Petrohrad). Druhá a třetí skupina potkanů se 7 osobami byla operována 6 dní po prvním. Do této doby se vícevrstvé vrstvy vytvořily ze suspenze zasetých keratinocytů v Petriho miskách, které byly transplantovány krysám. Druhá skupina byla transplantována epidermocyty na film, třetí skupina - s vícevrstvou vrstvou bez substrátu. Po 7 dnech byly vícevrstvé vrstvy alogických keratinocytů (MPALK) vysety na Polypore filmech transplantovány kulturou přímo na povrch rány. Nahoře se film, aby se zabránil jeho roztržení, byl fixován vícevrstvým gázovým dresinkem a šitý na kůži potkanů.

Před přesazení keratinocyty třetí skupinu krys, pěstované bez substrátu, vytváří oddělení práškového aktivního uhlí ze dna misky dispáza léčení Petri, který má schopnost se selektivně přerušit komunikaci Dermo-epidermální. Působením vícevrstvého zásobníku dispáza ničí spojení bazální vrstvy buněk na dně Petriho misky a v mnohem menší míře, má vliv na mezibuněčnou komunikaci, díky němuž je možné „odstranit“ celou vrstvu. Oddělení vrstvy vícevrstvých buněk odložením bylo provedeno následovně. Z Petriho misky mísí transportní médium, buněčné desky byly třikrát promyty médiem obsahujícím antibiotika, zejména - gentamycin (0,2 mg / ml). Vícevrstvé vrstvy se nalije 0,125% roztoku dispázy ( «Sigma») a umístí se do inkubátoru, kde byly inkubovány při t = 37 ° C po dobu 20-30 minut. Vzhled bílé koruny, odlupování po obvodu nádrže - ukazatel na začátek procesu oddělením od okrajů a spodní části Petriho misky. Několik minut po začátku separačního procesu, dispáza roztok vyprázdněn 2-3krát epitelové vrstvy byly promyty médiem. Na byl aplikován povrch epidermální vrstvy, řezané na velikost šálku kousek sterilní obvaz „Leith-barvy, který se štěpí oddělí dispázy tvorbu, dále delaminaci dně šálku špachtlí. Použití oční pinzety vrstva spolu s povlakem vložky“ Leith barvy „(rusky ) odtrhl od dna Petriho misky a opatrně přeneseny na připravený povrch jizvy. Ubrousky „Lita-color“ obsahuje ve svém složení a gentamicin eksolin (kolagen extrakt), která, když je vlhký prostředí zůstává kapustu v budoucnu Shem solný roztok se zvětšila a stala moderní hojení povlak, který poskytuje dobrou ochranu před vnějším infekcím a rychlému hojení kvůli počáteční vlhkosti strukturou.

Ve filmu „Polipor“ ubrousky „Leith-color“ překrývají vícevrstvé gázové obvazy, které jsou šité na kůži krys na jejich silnější fixaci. Každá krysa je uložen v jedné buňce, je vytvoření optimálních podmínek pro jeho obsah a přihojení transplantovaných keratinocytů. Bandáže krysy, že každý den transplantované odpružení a vícevrstvou nádrž epidermotsitov záběr dispáza, několikrát za den, navlhčí se sterilním fyziologickým roztokem pro vytvoření co nejpříznivějších podmínek buňky pro štěpu. Vzhledem k tomu, že „Polipor“ film byl nepropustný pro vodu, krys druhé skupiny zvlhčovacích obvazy neprovádí, což byla jedna z výhod fólií bez předchozího transplantace. Po 10 dnech byly bandáže odstraněny. Klinický obraz jizev po transplantaci buněk příliš nelišil od transplantace bez jizev, kromě růžové zbarvení je (přes dermabrasion) a další peeling. Tento fakt to naznačuje. že bezprostředně po vymizení krycího rána s IPC nedošlo v bachoru k žádné změně.

Užívání materiálu biopsie u potkanů.

Po 1, 2, 5 a 9 měsíců po transplantaci keratinocytů na krysy allogichnyh pozemní jizvy bílé krysy, přičemž je vyrobený materiál pro histologické, cytomorphological a elektronové mikroskopické studie. Jako kontrolní vzorky normální kůže krysy a jizvy byly odebrány bez transplantace buněk. Anestezie u potkanů byla prováděna etherovou anestezií.

Po anestezii označených úseky, na které transplantovány keratinocyty biopsie razidlo o průměru 2 mm. Zjizvená tkáň plátky byly odebrány a umístěny do 2,5% roztoku kyseliny glutarové aldehydu pro přípravu materiálu pro elektronové mikroskopické vyšetření. Kousky tkáně odebrané pro histologické vyšetření se umístí do 10% neutrálního roztoku formalínu a následně prostřednictvím zapojení alkoholů a plní do parafinu, následuje řezání ultratenkých sekcí a jejich prohlížení ve světle-optického mikroskopu.

Ovládání I. Normální potkanová kůže.

Chcete-li zjistit rozdíl mezi mikroskopický obraz normální jizvy změněných krys kůže a zjizvení po určitou dobu po transplantaci IPC, obrázky a popisy jsou uvedeny na ně ve všech fázích studie.

Epidermie normální pokožky se skládá z 7-9 vrstev buněk. Horní vrstva mírné tloušťky. Na místech, kde se skládá z 6-8 vrstev horní váhy. Základová vrstva je reprezentována buňkami válcového tvaru s velkým světlem, pravidelnými jádry a několika nukleoly. Desmosomální spojení mezi buňkami a bazální membránou jsou jasně vyjádřeny. Za dobře definovaných bazální membrány, která má jemné výčnělky v subepidermální vrstvy ležících rovnoběžně se jemné svazků kolagenu a elastinu vláken, včetně prodloužených fibroblasty, malých plavidel. V hlubších vrstvách jsou svazky kolagenových a elastinových vláken v různých směrech. Mezi nimi existuje mnoho nádob s tenkými stěnami stejného ráže, buněčných prvků (fibroblasty, žírné buňky, leukocyty). Ve velkém počtu vlasových folikulů, mazových žláz.

Kontrola 2. Jizva krysy ve věku 2 měsíce.

Klinický obraz. Jizvy bledě růžové, s peelingem, v místech, kde kosti zůstávají. Jejich plocha je snížena v důsledku kontrakce kolagenových vláken a stát přibližně 3,0 - 3,5 cm ^:. Kožní příchytky chybí.

Mikroskopický obraz. Epidermis se skládá z 3-5 vrstev buněk, plisé, zastoupené zaoblenými bazálních buněk, jeden řádek subulate, 1-2 řádky keratohyalin granule se zrny v horní vrstvě, jsou části intracelulárního edému. Vrstva rohovky se heterogenně mění z velmi tenkého na zhuštěný. Tam je sklopení břicha kvůli (kontrakce) jizvy tkáně. Záhyby pronikají do papilární vrstvy a vytvářejí dojem papil. Hranice mezi epidermis a dermis je přímka. Bazální membránu nelze vysledovat všude. Ve spodní části subepidermálních a hlubších vrstev - nádoby s tlustou, uvolněnou stěnou, mnoho opuštěných se stasovými jevy. Kolem nádob - hromada makrofágů, fibroblastů. Makrofágy obklopují erytrocyty vznikající z kapilár a fagocytifikují je. V povrchnějších vrstvách - malých kapilářích. Pod pokožkou jsou kolagenová vlákna uvolněná. V hlubší vrstvě bachoru - hrubých svazků kolagenových vláken, mezi nimiž je mnoho fibroblastů.

Jeskyně potkana měsíc po transplantaci potkaních keratinocytů MPAl potkanů.

Klinický obraz. Jizvy růžová, jejich plocha je snížena, a to zejména v průměru, s průměrem 2,5-3 cm ². Vlasy a mazové žlázy chybí.

Údaje mikroskopického vyšetření materiálu získaného z potkanů s transplantací MPALK na filmu a MPALK bez substrátu jsou prakticky totožné. Nicméně, technicky, práce s MPAlK nepodporovaným mnohem složitější a pracnější než když rostou MPAlK na podkladu, takže další studie emise na transplantaci kertainotsitov jizvy jsme použili jako základ pro pěstování ( „substrát“) vrstvený trávníku.

Mikroskopický obraz. Zesílení epidermis na 15 až 20 vrstev, téměř k polovině které mají keratinocyty úzký, protáhlý, vertikální tvar a kompaktní uspořádání. Bazální buňky jsou uspořádány v nerovném směru. Jádra těchto jader jsou lehké, velké, kulaté s jedním nebo dvěma nukleoly, což naznačuje jejich vysokou syntetickou a proliferační aktivitu. Hranice mezi epidermis a dermis je přímka. Trojitá vrstva je dobře vyvinutá, skládá se z 3 až 5 vrstev buněk kulatého tvaru, jádro obsahuje 2 nukleové buňky.

Bezprostředně pod bazální membránou - plotnoraspolozhennye tenké svazky kolagenních vláken paralelně k velkému počtu plavidel zapustevshih hlubší kolagenová vlákna hrubší sebrané do úzkých svazků. Mnoho velkých fibroblastů, žírných buněk (2-3 v zorném poli), makrofágy, leukocyty a prázdné cévy, jejichž stěny jsou uvolněny, kolem nich jsou volně umístěná kolagenová vlákna. V některých nádobách - staze, diapedesis jednotných prvků. Kolem cév - fibroblasty, jednotlivé lymfocyty. Kožní příchytky chybí.

Když se suspenze keratinocytů transplantuje na leštěnou jizvu, mikroskopický obraz se liší od předchozího. U většiny zvířat - epidermis je tenká, skládá se z 5-6 vrstev buněk. Spodní vrstva se skládá z buněk nepravidelného, mnohoúhelníkového tvaru se zaoblenými nepravidelně tvarovanými jádry. Stav subepidermální vrstvy je podobný stavu ve skupině zvířat bez transplantace.

V tomto případě lze mluvit buď o zpoždění procesů doprovázejících buněčnou transplantaci, nebo o velkou ztrátu buněk transplantovaných ve formě suspenze. Proto bylo učiněno závěr, že korekce jizvy transplantací keratinocytů ve formě suspenze je nevhodná.

Jizvení potkanů 2 měsíce po transplantaci potkaních keratinocytů potkaních MPA1.

Klinický obraz. Jizva vypadá tenká, něžná. V místech se vyskytuje ekdýza, váhy.

Mikroskopické obrázky. Stratový corneum je na místě - hyperkeratóza. Epidermie je zesílená, skládá se z 12-20 řádků buněk. Hranice mezi epidermis a dermis je přímka. Jemné kolagenové vlákna pod pokožkou leží velmi těsně. V hlubších vrstvách bachoru jsou shromažďovány v hrubých velkých svazcích. V subepidermální vrstvě se objevuje nová formace nádob. V dolních vrstvách jizvy - mnoho prázdných cév, které se nacházejí rovnoběžně s povrchem pokožky. Velké fibroblasty jsou rovnoměrně rozloženy v tloušťce bachoru, tam jsou obří, mnohostranné, mnoho makrofágů.

Jeskyně potkanů 5 měsíců po transplantaci MP krysího spermocytu.

Klinický obraz. Jizva vypadá hladká, hladká, bez odlupování, existuje jediný vlas jejich větší hustoty na okraji jizvy, což svědčí o hrany zarůstání vlasové folikuly v bachoru a nádor vlasových folikulů. Oblast jizev se nadále snižuje.

Mikroskopický obraz. Epidermie je stále hustá (15-20 vrstev, někdy až 30) v horních vrstvách je naplněna zrny keratogialinu. Bazální membrána je jasně viditelná. Pod jejími kolagenovými vlákny se uvolní. V dolních vrstvách - kolagen je silnější a těsněji zabalený. Mezi trámy kolagenu je mnoho kapilár. V horních vrstvách se snížil počet prázdných nádob. Epidermis a dermis jsou lehce zvlněné. V jizvařské tkáni jsou hluboké epidermální výrůstky. Mezi kolagenovými vlákny jsou vidět nově vytvořené nádoby. Objevují se jednotlivé vlasové folikuly a mazové žlázy.

Jeskyně potkanů 9 měsíců po transplantaci epidermocytů potkaních potkanů IPA.

Klinický obraz. Jizvy jsou mnohem menší ve srovnání s předchozími obdobími a jejich plocha o průměru 1,5-2,0 cm ². Jizvy jsou nerovnoměrně pokryty tenkými vlasy, zejména kolem obvodu. Menší škálování malých desek je zachováno.

Mikroskopický obraz.

Epidermis se stala tenčí, reprezentovala se z 6-8 řádků buněk, připomínajících epidermální strukturu normální kůže krys, pouze hustota buněk o 1 mm. Vyšší a jsou menší. Základní vrstva se skládá z malých buněk kulatého válcového tvaru. Bazální membrána je dobře definovaná, hemidesmosomy jsou jasně viditelné. Zaznamenává se výskyt epidermálních výrůstků v subepidermální vrstvě. Papilární vrstva je vyjádřena po celé délce jizev. Tyto skutečnosti ukazují, že po tuto dobu se adheze transplantovaných keratinocytů stala mnohem trvanlivějšími se základními tkáněmi bachoru. V důsledku toho může být péče o jizvy lidí s transplantací MALC 9 měsíců po transplantaci IPC tradiční. Pod pokožkou jsou jemnější kolagenová vlákna než v hlubokých vrstvách. Tam bylo mnoho lodí, zvláště povrchně umístěný. Ve větších nádobách jsou stěny zesíleny. Vlasové folikuly a mazové žlázy ve velkém množství. Mikroskopický vzorec připomíná kožní tkáň.

Výsledky experimentální práce a jejich diskuse.

Během této práce na umělých kožních jizev krys po operaci dermabrasion, transplantovaných keratinocytů v různých formah- na rány povrchů, jako suspenzi ve batist a vrstvené tvorby bez substrátu. Práce byla provedena za účelem získání morfologických údajů o účinku transplantovaných alogenních keratinocytů na jizvy, jakož i určení optimálních variant transplantace.

Bylo zjištěno, že všechny tři metody přesazení reálný, ale bez transplantaci Mpaka podkladu - velmi pracný postup, během kterého může být Mpaka zraněného, se odráží na výsledcích transplantace. Kromě toho tato metoda transplantace vylučuje práci na velkých plochách.

Keratinocytů suspenze Transplantace - výrazně ekonomičtější způsob nevyžaduje dlouhé kultivaci buněk a jednoduché v tomto provedení, kontakt pomocí sterilní batist předlisků, jehož rozměry odpovídají hodnotě zjizvení. Zpomalení terapeutického účinku během transplantace buněčné suspenze po dobu přibližně jednoho měsíce ve srovnání s MIC na povlaku poranění není významným momentem s trváním léčby, počítáno v mnoha měsících. Je známo, že během transplantace IPC k popálení pacientům došlo k postupné změně stavu struktury pokožky a po několik let. Transplantace keratinocytové kultury na krytech ran je nejvhodnější a slibnější metodou, nicméně je také mnohem dražší. Kromě toho vyžadují dnes prohledávání sofistikovanějších povlaků, které musí být plastické, hygroskopické, mají bakteriostatické nebo baktericidní vlastnosti a jsou biologicky neutrální pro buňky. Film „Polipor“ - meziprodukt verze domácího filmu rány pokrytí, i přes některé nedostatky, nám umožnila studovat experimentálně keratinocytů transplantačních krys na jizvy a vyvodit závěry o efektivitě tohoto směru přitažlivosti jizev.

Autoři, který provedl transplantaci na rány IPC zápalné, poznamenat, že v průběhu prvního týdne po transplantaci vícevrstvého zásobníku keratinocytů na rány dezinfikované, epidermis zhoustne a stratifikovaný. Všechny vrstvy epidermis byly dobře definovány. Je zajímavé, že počet buněčných vrstev v transplantacích je o 10-30% větší než u vzorků kožní biopsie. Autoři zaznamenali vzhled granulí keratogialinu pátý den po transplantaci MPA, bazální membrány a hemidesmosomů - již třetí den.

J. Rives a kol. (L994), Paramonov BA (1996); NM Kuznetsov et al. (1998) zjistili, že během prvních období po transplantaci pacientům BMD polnosloynymi kožních defektů po popáleninách, komunikace mezi dermis a epidermis je velmi slabá a je přímka, papilární vrstva chybí. Do konce druhého měsíce se začíná vytvářet mělké papily a příměsi kůže, spojení mezi dermis a epidermis se stává odolnější. Údaje z literatury hovoří o transplantaci alogenních keratinocytů na ranách spálených pacientů jako o slibné metodě. Navzdory skutečnosti, že odmítnutí alogenních keratinocytů dochází předložené různými autory v době od 10 dnů do 3 měsíců, nicméně, oni hrají roli v hojení rány povrchu, uvolnění růstových faktorů a mechanicky uzavření defektu. Předpokládá se, že MPALK má sníženou antigenní aktivitu, protože v průběhu kultivace in vitro ztrácejí Langerhansovy buňky, což jim umožňuje v organizmu příjemci existovat po dlouhou dobu. Kromě toho má alogenní kultura získaná z kůže mladých zdravých lidí nesrovnatelně vyšší biologický potenciál než autologní kultura pacientů po traumatu.

Hlavním cílem naší studie bylo zjistit, zda alogenní keratinocyty přežijí na jizezích a jaké budou změny v jizvařské tkáni pod vlivem takového biologicky aktivního "povlaku na rány". V případě pozitivního výsledku vyvine nejúčinnější a nejméně pracovně náročnou technologii v této oblasti rehabilitační medicíny.

Údaje, které jsme získali v mnoha ohledech, se ukázaly být podobné literárním údajům o morfologických změnách v lidské epidermis po přenosu alogenních keratinocytů na popáleniny. Existují však významné rozdíly, a to jak z morfologického substrátu, který je transplantován, tak z hlediska technologií. Takže. Tvorba bazální membrány a dermální-epidermální vazeb (poludesmosom, papily), provádí se v pozdější době ve srovnání s přenosem keratinocytů na rány povrchů bez jizvení. Zdá se, že to je způsobeno špatnou výživou tkání břicha ve srovnání s dermis nebo svalovou fascií. Jizva, zejména stará, je hustá pojivová tkáň s velmi malým počtem cév, spodní část hořící rány je granulační tkáň bohatá na krevní cévy. Je tedy zřejmé, že podmínky, za kterých dochází k transplantaci a přeměně keratinocytů, jsou zcela odlišné. Čím více se vaskularizuje oblast transplantace buněk, tím je snazší je zpracovávat. Z tohoto postulátu je závěr o preferenci práce s mladými jizvy, u kterých je spojivové tkáně stále volné a bohaté na krevní cévy.

V důsledku této experimentální práce je dokázáno, že:

1. Transplantace MALKu na jizvy je možná. 
2. Optimální metodou transplantace je transplantace keratinocytů na krytu rány.
3. Povrch jizvy by měl být mletý pomocí operační dermabraze pomocí Schumannova laseru nebo frézy.
4. Pod vlivem MPALK nastává rychlá epitelizace půdního povrchu bahna.
5. Lepší vaskularizovaná jizva, tj. Čím je jizva mladší, tím lépe jsou výsledky transplantace keratinocytů.
6. Tkáň jizvy pod vlivem transplantovaných keratinocytů se postupně transformuje a změní se na dermálně podobnou (drobnější tkáň jizev s příměsí kůže).
7. Postupné uvolňování jizvy začíná podepidermální vrstvou. Zlepšuje jeho vaskularizaci, svazky kolagenových vláken v horní a spodní části bachoru se nacházejí v drobnějším místě než v jizvařské tkáni bez transplantace buněk. Tam jsou vlasové folikuly a mazové žlázy. Epidermis ve své struktuře, po absolvování fáze hypertrofie, se blíží k epidermis normální kůže.
8. Pozorované změny se týkají keratinocytů secernované růstové faktory, cytokiny, které zlepšují trofismus jizevnaté tkáně přispívají k jeho transformaci z tuhého vazivové tkáně volnější, což vede ke zlepšení jizvy.

Na základě této studie lze tedy dospět k závěru, že příznivý účinek transplantovaných keratinocytů na tkáň jizvy, který může mít praktický význam pro rehabilitaci pacientů s různými typy jizev.

Tato práce na potkanech také umožnila formulovat požadavky. Na rány, na kterých rostou keratinocyty.

Povlaky ran by měly být:

• biokompatibilní s buňkami,
• prodyšný,
• mají elastickou základnu,
• být hydrofilní,
• protože léčivé přísady obsahují antibakteriální léky a antioxidanty nejsou toxické pro kultivované buňky.

Klinické výsledky biotechnologického ošetření jizev.

Dříve, N. Carver a kol. (1993) zjistili, že okluzivní obvazy jsou možná podporuje vazbu k ráně a přežití keratinocytů, ale neumožňují pro vytvoření vrstvené (mature) epidermis. K vytvoření stratifikované pokožky je nezbytné vzduchové prostředí. Proto se po upevnění vícevrstvého zásobníku okluzivní rány povlaku je 7-10, aby se odstranily a udržet obvazů na rány za sucha nebo ve vodě rozpustných masti. Dá se říci, že kvalita a vlastnosti z „podložky“, na které se pěstují buňky, je velmi důležitý okamžik pro účinnost transplantaci buněčného materiálu, a tím i pro výsledky práce lékařů. Ale ideální obvaz pro dnes není, navzdory hojnosti navrhovaných variant (umělé kůže, netkané textilie z karboxymethylcelulózy, fibrinové povlaky, semipermeabilní polyurethan filmem). Ne nedůležitý aspekt jsou náklady na „substrát“ v této problematice (speciální obvazů ran), jak je jejich vysoká cena zvyšuje celkové náklady na biotechnologického zpracování.

Účinnost buněčných technologií byla doposud prokázána, ale tyto technologie jsou bohužel velmi drahé, zejména v zemích, kde není zavedena průmyslová výroba buněčných kompozic. Nicméně země jako Spojené státy již dlouho vytvořily průmysl pro výrobu buněčného materiálu pro transplantaci spáleného. Zejména společnost BioSurface technologie Inc, od roku 1989, zvýšil 37,000 laminovaných vrstev keratinocytů, které byly použity k léčbě 240 pacientů v 79 zemích po celém světě (R.Odessey, 1992) s 1 cm ² buněčné kultury stojí asi 7-8 $ US.

Technologie léčby různých onemocnění a kožních problémů má řadu rozdílů, avšak v centru každé léčby buněk je produkce kvalitního buněčného materiálu a jeho transplantace.

Tento proces se skládá z následujících kroků:

• výběr kůže od postižených (nebo od dárců),
• přepravu kožních chlopní do biotechnologického centra,
• izolace buněk bazální vrstvy a jejich množení,
• vytváření vícevrstvých vrstev keratinocytů (IPC).
• transplantace buněčných kultur.

Hlavním problémem při léčbě transplantací vícevrstvých vrstev keratinocytů je potřeba životaschopných buněk ve všech fázích transplantace buněk. Části kůže pro izolaci autologních nebo alogenních buněk by měly být co nejtenčí, protože v tomto případě je snadnější jejich oddělení pomocí mechanických a enzymatických metod a získání suspenze živých buněk pro růst. Mohou být získány odříznutím dermatomu nebo použitím kůže očních víček, předkožky, vnitřního povrchu ramene. Vzhledem k tomu, že buňky jsou citlivé na halogeny (chlor, jod), peroxid vodíku, nemohou být použity při ošetřování pokožky v době, kdy se materiál odebral.

Kvantitativní a kvalitativní výtěžek buněk z kožních štěpů a účinnost jejich kultivace závisí také na zdravotním stavu a věku dárce. Vzorky kožní biopsie by měly být dodány do laboratoře co nejdříve a ve vhodných podmínkách (prostředí, teplota) dodány do certifikované a akreditované laboratoře.

Eagleovo médium nebo médium 199 s přídavkem 10% hovězího séra, DMEM média doplněného 5% fetálním hovězím sérem a antibiotiky mohou být použity pro uchovávání a transport kožních chlopní.

V Cytologické dermální biopsie se nejprve mechanicky rozdělí na malé kousky s následnou léčbu kožních kusů za použití enzymů: trypsin, kolagenáza, dispáza, a jiní.

Při působení enzymů dochází k destrukci desmosomů a keratinocyty se uvolňují do média jako samostatné buňky nebo agregáty sestávající z různého počtu buněk. Pro kultivaci se používají pouze bazální keratinocyty, které se pěstují na speciálních médiích v inkubátorech obsahujících 5% CO, v Petriho miskách nebo v lahvičkách při t = 37 ° C. Během 48 hodin se pozoruje tvorba keratinocytových kolonií, které postupně konvergují do monovrstvy. Po získání dostatečného počtu buněk se výsledná suspenze rozloží na kryty na rány připravené pro tento účel a umístí se do Petriho misky. Z suspenze se nejdříve vytvoří monovrstva a pak vícevrstvá vrstva keratinocytů. Schematicky jsou fáze procesu kultivace keratinocytů znázorněny na obr. 12 (33,43,54,65).

Vytvoření vícevrstvé keratinocytové formace vhodné k transplantaci obvykle trvá 7-10 dní. Někdy je toto období delší, což závisí na kvalitě zdrojového materiálu (věk, zdraví dárce, správnost materiálu, kvalita použitého média atd.). Pokud vícevrstvá vrstva převrátí, pak na jejím povrchu mohou být buňky s apoptózními jevy nevhodnými pro transplantaci. Petriho misky, které se v nich naplňují na krycích vrstvách vrstvami keratinocytů (IPC), jsou dodávány na kliniku ve zvláštních nádobách při teplotě nejméně + 15 ° C.

Modifikovaná metoda Greenova pro růst IPC

Při naší práci jako povlaku na rány jsme použili vícevrstvý cambric, opouštějící polypórové filmy, s nimiž jsme začali pracovat na experimentu s potkany. Tedy vícevrstvé vrstvy keratinocytů byly pěstovány u nás na prefat a sterilní batiste, ačkoli to také není optimální krytí rány.

Klinické studie byly prováděny na dobrovolnících s dodržováním nezbytných etických norem: podepsání smlouvy a informovaný souhlas.

1. Byla aplikována kultura vlastní (autologní) a odebrána z buněčných buněk (alogenních) keratinocytů.
2. Vlastní keratinocyty byly získány z kusu pokožky řezané zevnitř ramen pacientů.
3. Operace dermabraze jizev byla prováděna pomocí termokoupů, rotačních disků a erbového laseru.
4. Byly provedeny skupiny pacientů s normotrofickými, hypotrofickými a hypertrofickými jizvy.

Technologický postup pro aplikaci buněčné technologie ke zlepšení typu kožních jizev se skládal z následujících fází:

1. Výběr pacientů.
2. Vysvětlete podstatu léčby, načasování získání očekávaných výsledků, podepsání smlouvy a informovaný souhlas.
3. Určení pacientů 2-3 týdny před operací selmevit o 1t. 3krát denně, zinkteral na 1t. 3 krát denně.
4. Vzhledem k získání autologních keratinocytů se z vnitřní strany ramene, vysoko, téměř na spodní části axilární oblasti, odebral kus kůže 2 cm dlouhý a 0,7 až 1,0 cm široký.
5. V případě, že pacienti odmítají izolovat své vlastní keratinocyty kvůli možnosti získat lineární jizvu na vnitřním povrchu ramene, byl buněčný materiál odebrán z buněčné banky (alogenní keratinocyty).
6. Keratinocyty byly izolovány a pěstovány v podmínkách laboratoře certifikované pro tento typ práce.
7. Po obdržení IPC dostatečného pro transplantaci byl podán den operace jizvy na klinice, kde byl materiál přiváděn do Petriho nádobek do speciálních nádob.
8. Byla provedena operace dermabraze bachoru, byla provedena hemostáza, povrch byl promyt sterilním fyziologickým roztokem, vysušen, poté byl IPC transplantován na sterilní batiste "buňky dolů". To znamená, že buňky, které byly v horní části MIC, byly nižší, přiléhající k leštěnému povrchu.
9. Na vrchní straně byla umístěna sterilní fólie, která byla na kůži připevněna elastickým obvazem nebo elastickým pásem Omnifix. Namísto filmu mohou být také použity lhostejné povlaky na rány obsahující silikon, například Mepitel, Mepiform, silikonové gelové desky.

Po 5-7 dnech se film nebo silikonový potah odstraní. Během této doby se všechny keratinocyty musí plazit na leštěnou jizvu a připevnit se k jejímu povrchu.

10. Mokré prostředí vytvořené pod filtrem a silikonovým povlakem aktivně přispívá k tomu. Baptista zbývající na jizvě od tohoto bodu může být impregnován zvědavým nebo chitosanovým gelem. Výsledkem je, že 2. Den se vytvoří hustá kůra, která je pro pohodlí pacienta lepší fixovat pomocí elastické omítky, jako je například Omnifix. Prodyšná kůže umožňuje nově vytvořené pokožce rozlišovat a proměnit se do zralého.

V závislosti na druhu jizev a hloubce broušení je obvaz odmítnut po 8-10 dnech. Epidermie v této době má 30-40% více buněčných vrstev než v normální kůži. Bazální membrána není tvořena. Keratinocyty zhuštěné epidermis uvolňují do biopsie tkáň biologicky aktivní molekuly.

Úspěch biotechnologického léčení jizev velmi závisí na způsobu, jakým jsou v pooperačním období ošetřovány. Buněčné kultury jsou "něžným" typem krytí rány av počátečních obdobích po transplantaci lze BMD snadno oddělit od podkladových tkání. Proto se doporučuje, aby se pacienti po operaci postarali o jizvu. Po dobu 8-9 měsíců neotírejte a snadno nepoužívejte studenou vařenou vodou, abyste se vyhnuli ripování tenké, nově vytvořené pokožky, která nemá těsné uchopení s podkladovými tkáněmi.

Poznámka:

Před operací a při použití dermabrasion halogenovaných oxidačních činidel a konzervačních látek (yodopiron, sulyodopiron, iodinol, yodinat, chlorhexidin, peroxid vodíku), je přípustná i před transplantací kletok- absolutně kontraindikováno vzhledem k jejich cytotoxické účinky. Toxické pro buňky jsou také methylenová modř. Brilantně zelená.

Aby se zabránilo infekci, zvláště při práci s hypertrofickými jizvy, je možné ošetřit pracovní pole neomycin-sulfátem, polymyxinem nebo gentamicinem. Nevykazují cytotoxický účinek na keratinocyty.

Výsledkem tohoto ošetření je dosažení trojitého účinku.

1. Srovnání povrchu bachoru.
2. Vytvořte nad ní vrstvu nové epidermis s normální tloušťkou.
3. Konverze jizevnaté tkáně v dermopodobnuyu působením cytokinů, růstových faktorů a jiných biologicky aktivních molekul secernovaných transplantovaných buněk a keratinocytů stimulovaných jimi, fibroblasty a makrofágy.

Jizva se stává méně nápadná, pružnější, v ní se objevují póry, vlasy nafouknou, pigmentace může být obnovena kvůli přítomnosti melanocytů v MPC.

Všechny tyto pozitivní okamžiky v cikatrice však nepřicházejí okamžitě. V tomto ohledu je nutné upozornit pacienty. že proces transformace tkáně jizvy do dermis je pomalý a optimální výsledek takové léčby lze očekávat nejdříve 10-14 měsíců. Bezprostředně po odmítnutí obvazů mají leštěné povrchy výrazný polychrom, čímž je proces broušení jasnější. Nejmenší poškození kůže nastává při broušení normotrofických jizeč erbiem. Barva jizev a okolní kůže byla obnovena v období od 3 do 8 týdnů. Navzdory těmto opatřením je někdy pooperační hyperpigmentace, která může pokračovat nezávisle po dobu několika měsíců.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16]