Laboratorní diagnostika tuberkulózy

Tuberkulóza je onemocnění, které lze snadno diagnostikovat v moderních podmínkách a vědeckých úspěších. Laboratorní diagnostika tuberkulózy je ústředním bodem pro jiné diagnostické metody, za druhé pouze pro rentgenové metody výzkumu.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8]

Klinický krevní test

U pacientů s tuberkulózou nejsou změny ve všeobecné analýze krve patognomické. S ohledem na omezené a inaktivních forem tuberkulózy hypochromia charakteristiku erytrocytů v normální množství. Když masivní infiltráty nebo kaseózní pneumonie, zatímco prevalence kaseózní lymfadenitida specifických střevních lézí, stejně jako pro velké plicní nebo pooperačního krvácení a poznámka erythropenia mikrocytózy, oligohromaziyu, polihromaziyu. Makrocytóza a zejména poikilotsitoz se setkávají mnohem méně často, obvykle s těžkou anémií. Počet retikulocytů v kroku tuberkulózy kompenzována v rozmezí od 0,1 do 0,6%, s subcompensated - od 0,6 do 1,0% a 1% je charakterizována dekompenzovaných retikulocytů.

Když tuberkulóza v některých případech může být mírný leukocytóza (až 15 tisíc leukocytů.), Méně záření, které se vyskytují v 2-7% pacientů s omezenými a snadno forem procesu se vyskytující a v 12,5% - destruktivní a progresivní plicní tuberkulózy .

Nejčastější změny se vyskytují ve vzorcích leukocytů. Označte jak relativní tak absolutní neutrofilii, mírný posun leukocytového vzorce doleva před promyelocyty. Myelocyty jsou velmi vzácné v případě nekomplikované tuberkulózy. Zvýšení počtu neutrofilů s abnormální zrna u pacientů krevního obrazu TB vždy udává délku procesu: u pacientů s těžkou tuberkulózou téměř všechny neutrofily obsahují abnormální obilí. Po ukončení vypuknutí tuberkulózy se jaderný posun poměrně rychle blíží k normálu. Patologická granularita neutrofilů obvykle trvá déle než jiné změny na hemogramu.

Obsah eosinofilů v periferní krvi se také liší v závislosti na fázi procesu a na alergickém stavu organismu. Jejich počet se snižuje až do aneozinofiliya na těžkou a dlouhodobou ohniska nákazy a naopak se zvyšuje, jak se resorpce infiltráty a pleurální výpotek, jakož i časné formy primární tuberkulózy.

Většina forem primární tuberkulózy je doprovázena lymfopenií, která je někdy pozorována po řadu let, i po zjizvení specifických změn. Sekundární tuberkulóza ve fázi exacerbace může být v závislosti na závažnosti tohoto procesu doprovázena buď normálním počtem lymfocytů, nebo lymfopenií.

To zaujímá zvláštní místo určující rychlost sedimentace erytrocytů Další testy pro vyhodnocení tuberkulózní proces (ESR), který má hodnotu v hodnocení procesu tuberkulózy toku a identifikaci jeho aktivní formy. Zvýšení ESR indikuje přítomnost patologického procesu (infekční protizánětlivé, hnisavé septický, hemoblastózy, Hodgkinova a kol.), A svědčí o jeho závažnosti, ale normální hladiny ESR ne vždy ukazují nepřítomnost patologie. Zrychlení sedimentace erytrocytů přispívá ke zvýšení krevní hladiny globulinů, fibrinogenu, cholesterol, a snižuje viskozitu krve. Zpomalení sedimentace erytrocytů je charakteristické pro stavy spojené s hemokoncentrací, zvýšením obsahu albuminů a žlučových kyselin.

Hemogram u pacientů s tuberkulózou se během léčby mění. Hematologické posuny zmizí rychleji, tím lépe terapeutický zásah. Nicméně je třeba mít na paměti vliv hepatitidy na různé antibakteriální léky. Často způsobují eozinofilii, v některých případech - leukocytózu a častěji leukopenii až po agranulocytózu a reakci lymfoidní-retikulární. Systémová hematologická kontrola a správná analýza získaných dat jsou zásadní pro posouzení klinického stavu pacienta, dynamiky procesu a účinnosti léčby.

[9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16]

Klinická analýza moči

U tuberkulózy močového ústrojí je analýza moči hlavní laboratořní diagnostickou metodou. Můžete pozorovat leukocyturia, erythrocyturia, proteinurie, hypoisostenurie, tuberkulózu mycobacterium, nešpecifickou bakteriurii.

Leukocyturie - nejčastějším příznakem tuberkulózy močového systému před chemoterapií a neexistuje žádná specifická pouze ve výjimečných případech, jako je například kompletní obliterace lumen močovodu. Nechyporenko test (stanovení počtu leukocytů v 1 ml moči) pomáhá objektivněji posoudit stupeň leukocyturia nefrotuberkuloze s, a v některých případech ji určit normální vyšetření moči. Je však třeba vzít v úvahu, že se může objevit leukocytria u akutní a chronické pyelonefritidy, cystitidy, uretritidy, ledvin a ureterových kamenů.

Erythrocyturia. Stejně jako leukocyturia. Jsou považovány za jeden z nejčastějších laboratorních příznaků tuberkulózy močového měchýře. Frekvence hematurie závisí na prevalenci procesu, zvyšuje se tím, jak se v ledvinách rozvíjí destruktivní tuberkulózní proces. Erythrocyturia bez leukocyturia je typičtější pro počáteční stavy tuberkulózy ledvin. Hematuria, která převládá nad leukocyturií, je důležitým argumentem ve prospěch tuberkulózy ledvin při diferenciaci s nešpecifickou pyelonefritidou.

[17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26], [27]

Biochemický krevní test

Při tuberkulóze závisí změna některých biochemických parametrů především od fáze procesu, komplikací a různých souvisejících onemocnění. U pacientů s inaktivní tuberkulózou plic a jiných orgánů se celkové bílkovinné a proteinové frakce krevního séra nemění a určí jejich normální obsah.

U akutních forem onemocnění, stejně jako exacerbace a progrese chronických forem tuberkulózy klesá koeficient albumin-globulin.

Esenciální v posouzení funkčního stavu organického poškození a jater u tuberkulózy a jejích komplikací je stanovení celkového sérového a přímého bilirubinu, AST (ACT), alanin aminotransferázy (ALT). Dynamické stanovení hladiny aminotransferáz. Bilirubin v léčbě pacientů s tuberkulózou, zejména v těžkých formách, je povinnou součástí biochemického vyšetření pacientů s tuberkulózou a provádí se každý měsíc.

Posouzení funkčního stavu ledvin zahrnuje stanovení sérového kreatininu a výpočet rychlosti glomerulární filtrace podle vzorce Cockcroft-Gault. Výpočet míry glomerulární filtrace pomocí Reberova vzorku poskytuje méně přesné výsledky.

Hlavním cílem dynamických biochemických studií u pacientů s tuberkulózou je sledování průběhů procesu, včasná detekce nežádoucích účinků léků a adekvátní korekce výsledných homeostatických poruch.

[28], [29], [30]

Aplikace biochemických metod vyšetřování extrapulmonární tuberkulózy

Nejintenzivnějším ukazatelem je obsah kyseliny tuberostearové v biologických tekutinách, ale jeho definice je spojena s technickými potížemi (potřeba plynové chromatografie a hmotnostní spektrometrie).

Prospektivní měření aktivity adenosin-deaminázy - enzymu stanoveného v kapalinách: synoviální, perikardiální, ascitické nebo spinální. Hlavními producenty adenosin-deaminázy jsou lymfocyty a monocyty. Stanovení aktivity adenosin-deaminázy v biologických tekutinách usnadňuje diagnostiku tuberkulózní synovitidy, tuberkulózy lymfatických uzlin, tuberkulózní meningitidy, tuberkulózní serositidy.

Některé biochemické ukazatele vzhledem k jejich nespecifickosti se určují pouze v biologických tekutinách, které se blíží cíli lézí. Změřte hladinu indikátorů jako odpověď na subkutánní nebo intradermální injekci tuberkulinu (obvykle před a 48 a 72 hodin po ní). Poté se stupeň zvýšení stupně markeru (v%) vypočítá s ohledem na počáteční úroveň.

Optimální stanovení aktivity organom specifického enzymu transamnidázy v moči, jehož vzhled se projevuje při ovlivnění ledviny různého charakteru. Studium transamidinasy je opodstatněné pouze za podmínek subkutánní injekce tuberkulinu, aby se zhoršil lokální zánětlivý proces. Stanovte aktivitu transamidinu v moči zpočátku a 24-72 hodin po zavedení 50 TE tuberkulinu. Zvětšení fermentiy dvakrát a více umožňuje v 82% případů rozlišovat aktivní tuberkulózu ledvin od exacerbace chronické pyelonefritidy.

Při tuberkulóze ženských pohlavních orgánů se koncentrace haptoglobinu a malonického dialdehydu v krvi stanoví v podmínkách provokativního tuberkulinu. Subkutánně injikovaný tuberkulin v dávce 50 TE a 72 hodin později provedl druhou biochemickou studii. V případě etiologie tuberkulózy není stupeň zvýšení hladiny haptoglobinu nižší než 28% a úroveň malondialdehydu je 39% nebo více. Rovněž se používá stanovení aktivity adenosin-deaminázy v peritoneální tekutině získané z prostoru Douglase. Punkta je znovu vyšetřena 72 hodin po intradermální injekci tuberkulinu v dávkách 0,1 TE a 0,01 TE do projekce vnitřních pohlavních orgánů na přední břišní stěně. Ve prospěch tuberkulózního procesu je zvýšení aktivity adenosin-deaminázy o 10% nebo více oproti počáteční.

Když je oko postiženo, vyšetří se ohniska, která se vyskytuje v oku v reakci na antigenní stimulaci. Není žádoucí vyvinout výraznou reakci doprovázenou snížením vizuálních funkcí. Vzhledem k tomu, hodnocení minimální ohniskových účinků jsou často obtížné doporučit uzavření objektivizace je orientována rovnoběžně s, a na stupni zvýšení sérového haptoglobinu, nebo adenosin deaminázy.

Všechny biochemické studie by měly být prováděny ve spojení s jinými metodami.

[31], [32], [33], [34], [35], [36], [37]

Výzkum v oblasti koagulačního systému krve

Význam stavu výzkumu tohoto systému srážení krve TBC je způsobena přítomností řady pacientů s plicní tuberkulózy hemoptýzou nebo plicní krvácení, stejně jako hemokoagulačních komplikací v chirurgické léčbě tuberkulózy. Navíc latentní tok intravaskulární hemokoagulace, který přirozeně doprovází tuberkulózu, ovlivňuje průběh onemocnění a účinnost chemoterapie.

U pacientů s plicní TBC prevalence exsudativní záněty složky dochází k poklesu krevního antikoagulační aktivity. U pacientů s nízkou prevalencí konkrétní lézí v plicích s převahou produktivní hemokoagulace intravaskulární zánětlivou složkou mírně exprimován. U pacientů s plicní tuberkulózy s hemoptysis a plicního krvácení státního systému srážení krve se liší: u pacientů s nízkou ztrátou krve ve výšce gemoptoe nebo bezprostředně po jeho skončení je k prudkému nárůstu v krevní koagulační schopnosti v důsledku závažné intenzifikaci trombinoobrazovaniya při zachování zvýšené „konstrukční“ srážení krve. U pacientů s masivní ztráty krve pozorované snížení srážlivosti potenciál na úkor snížení koncentrace fibrinogenu. Aktivita faktoru XIII, počet krevních destiček. Ve fázi chirurgické léčby u pacientů s omezenými formami plicní tuberkulózy s významnými porušení dochází systém homeostáze. Pacienti s rozšířeným způsobem při výkonu pnevmon- nebo plevropnevmonektomii často vyvinout DIC, která může mít podobu „druhého nemoci.“

Pro sledování stavu srážení krve u pacientů s plicní tuberkulóza by mělo být provedeno stanovení aktivovaného parciálního tromboplastinového času (aPTT), fibrinogen, trombin, čas, index protrombinového a doby krvácení a čas srážení.

[38], [39], [40], [41], [42], [43]

Hormonální výzkum

Moderní experimentální a klinické pozorování naznačují přítomnost změn hormonálního stavu u specifického tuberkulózního zánětu plic. Je prokázáno, že korekce dysfunkcí hypofýzy, nadledvinek, hypofýzy, štítné žlázy systémů a pankreatické funkce ve spojení s anti-TB terapie přispívat k aktivaci fibrogeneze a opravy v určitém zánětu lokusu.

Funkční stav hypofýzy, štítné žlázy systému se hodnotí podle obsahu v krevním séru trijodtyroninu (T ₃ ), tyroxin (T ₄ ), hypofýzy hormon stimulující štítnou žlázu (TSH). Bylo zjištěno, že subklinická hypotyreóza je detekována v 38-45% pacientů s plicní tuberkulózy, a nejčastěji je diagnostikován s rozšířenou a fibro-kavernózní formy procesu. Za stejných forem většina výrazně snížené hladiny jak T ₃ a T ₄, a tam je nerovnováha těchto hormonů ve formě zvýšení poměru T ₄ / T _s.

Adrenokortikální funkce je hodnocena z úrovně kortizolu v krevním séru, a endokrinní funkce pankreatu - koncentrace imuno-reaktivní inzulínu. V akutní fázi infekčního onemocnění se zvyšuje potřeba endogenního kortizolu a inzulinu. Hyperinzulinémie také svědčí o inzulinové rezistenci tělních tkání, která je typická pro jakýkoli aktivní zánětlivý proces, zvláště specifický. Stanovení glukokortikoidní funkce nadledvin s aktivní plicní tuberkulózou umožňuje prokázat přítomnost hyperkortikis u většiny pacientů. Normální hladiny kortizolu koncentrace v krvi u pacienta s infekčního zánětu, v akutní fázi je třeba považovat za relativní selhání glukokortikoidy funkce kůry nadledvinek, který může sloužit jako základ pro držení dávky adekvátní substituce glukokortikoidů.

Téměř třetina pacientů s plicní tuberkulózou může prokázat, že hladina inzulinemie v nich je poměrně nízká a blíží se k dolní hranici normy, zatímco 13-20% pozoruje významný hyperinzulinismus. Relativní hypo- a hyperinzulinismus jsou vysokými rizikovými faktory pro vývoj porušení metabolismu sacharidů v různých stupních. Tyto změny ve funkční aktivitě buněk pankreatu B vyžadují pravidelné sledování glykémie u pacientů s tuberkulózou a včasnou prevenci diabetu mellitus. Navíc. Toto slouží jako dodatečné zdůvodnění pro účelnost použití fyziologických dávek inzulinu při komplexní terapii tuberkulózy.

Obecně platí, že nižší hladiny hormonů štítné žlázy a jejich nerovnováhy hypercortisolemia a hyperinzulinismus největší dosah u pacientů s těžším průběhem tuberkulózní proces, s rozsáhlým poškozením plic a závažné příznaky tuberkulózy intoxikace.

Mikrobiologická diagnostika tuberkulózy

Mikrobiologické studie jsou potřebné k identifikaci pacientů s tuberkulózou, ověření diagnózy, monitorování a korekci chemoterapie hodnotících léčebný výsledek, jinými slovy, jelikož zápis tuberkulózy pacienta před vyjmutím z registru.

Všechny epidemiologické programy a projekty jsou založeny na hodnocení počtu bakteriálních exkretorů, které nelze provést bez použití laboratorních metod k detekci tuberkulózy mykobakterií. V průzkumu tzv. Neorganizované populace dosahuje procento bakteriálních útočníků 70 nebo více, což způsobuje, že laboratorní metody jsou dostatečně účinným prostředkem pro identifikaci pacientů s tuberkulózou v této populační skupině.

Tradiční mikrobiologické metody pro diagnostiku tuberkulózy jsou bakterioskopické a kultivační studie. Moderní metody zvažují kultivaci mycobacterium tuberculosis v automatizovaných systémech, nastavení PCR. Všechny tyto metody se však nutně spojují s klasickými bakteriologickými metodami.

Sběr diagnostického materiálu

Účinnost laboratorních studií závisí do značné míry na kvalitě diagnostického materiálu. Dodržování pravidel pro shromažďování, uchovávání a přepravu diagnostického materiálu a přesná implementace algoritmu hodnocení pacienta přímo ovlivňuje výsledek a zajišťuje biologickou bezpečnost.

Pro testování tuberkulózy se používá řada materiálů. Vzhledem k tomu, že TB logkih- nejběžnější forma tuberkulózními léze je základním materiálem pro výzkum považovat sputa a jiných druhů oddělitelnou Tracheobronchiální: sekrece horních cest dýchacích, získané po inhalaci aerosolu: bronchiální promývání; bronchoalveolární výplachy; materiál získaný bronchoskopie, a intrapulmonární transtracheální biopsie z bronchiálních aspiráty, hrtanu stěrů, exsudátů z rány a stěry al.

Účinnost výzkumu se zvyšuje, pokud se provádí kontrolovaná sběr materiálu od pacienta. Za tímto účelem je přidělen zvláštní prostor nebo jsou zakoupeny speciální kabiny. Sběr materiálu je nebezpečným postupem, proto je nutné shromažďovat materiály pro výzkum, dodržovat pravidla infekční bezpečnosti.

Materiál pro testování na mycobacterium tuberculosis se shromažďuje ve sterilních lahvích s těsně nasazenými uzávěry, aby se zabránilo kontaminaci životního prostředí a chráněný materiál před kontaminací.

Lahvičky pro sběr diagnostického materiálu musí splňovat následující požadavky:

• musí být z materiálu odolného proti nárazu;
• by se během autoklávování měl snadno roztavit;
• dostatečný objem (40-50 ml):
• mít široký otvor pro sběr sleziny (průměr nejméně 30 mm);
• být snadno ovladatelné, průhledné nebo průsvitné, abyste mohli posoudit množství a kvalitu odebraného vzorku bez otevření víka.

K dosažení optimálních výsledků výzkumu je třeba dodržet následující podmínky:

• Materiál shromažďujte před zahájením chemoterapie;
• materiál pro studie musí být odebrán před ranním příjmem jídla a léků;
• pro výzkum je žádoucí shromáždit alespoň 3 vzorky ranného hlenu. Shromážděte sputum po dobu 3 po sobě jdoucích dnů;
• shromážděný materiál musí být co nejdříve doručen do laboratoře:
• v případě, kdy je materiál okamžitě nedostupný do laboratoře, je uložen v chladničce při teplotě vzduchu 4 ° C po dobu nejvýše 48 hodin;
• Při přepravě materiálu je třeba pečlivě sledovat celistvost lahviček.

Správně shromážděný sput je slizovitý nebo mukopurulentní. Optimální objem testovaného sputu je 3-5 ml.

Sputa se shromažďuje pod dohledem lékaře. Osoby odpovědné za shromažďování sputa by měly sledovat implementaci určitých pravidel:

• je nutné pacientovi vysvětlit účel studie a potřebu vykašlat sliny nebo nazofaryngeálního hlenu, ale obsah hlubokého dýchacího traktu. Toho lze dosáhnout v důsledku produkčního kašle, ke kterému dochází po několika (2 - 3) hlubokých dechách. Je také nutné varovat pacienta, aby si měl vypláchnout ústa vařenou vodou, aby odstranil hlavní část mikroflóry rostoucí v ústní dutině a zbytky potravin, které brání vyšetření sputa;
• lékařský pracovník, který se podílí na sběrači splachů, kromě županu a klobouku musí nosit masku, gumové rukavice a gumovou zástěru;
• stojící za pacientem se doporučuje udržet láhev co nejblíže k jeho rtům a okamžitě oddělit do ní hlen, jak to kašle, a musí být zajištěno, že tok vzduchu je směrován od zdravotníka:
• Po dokončení sběru sputu by lékař měl pečlivě uzavřít lahvičku s víčkem a posoudit množství a kvalitu shromážděného sputa. Pak je lahvička označena a umístěna ve speciálním pouzdru pro přepravu do laboratoře.

Nebo aplikovat dráždí inhalací pomocí zařízení, instalované v místnosti sbírat - v případě, že pacient nemá před časně ráno v den odběru materiálu potřebného mu dát vykašlávání :. Výtažek získávaný z kořenů marshmallow (mukaltin), bromhexinu, ambroxol, atd. Produkují hlen, noc hlen. Materiál shromážděný tímto způsobem nepodléhá ochraně a měl by být zkontrolován v den sběru. Aby se zabránilo jeho "ucpání" v laboratoři ve směru, mělo by být zvláštní značka.

Je-li toto zařízení neprovádí vyšetřování mikrobiologické shromážděné diagnostický materiál, které mají být centrálně dodány do laboratoře, kde musí provozovatel úspory materiálu mezi dodávkami v ledničce nebo pomocí konzervačních látek. Dodávejte materiál do laboratoře v přepravních bednách, které lze snadno dezinfikovat. Každý vzorek by měl být opatřen příslušným štítkem a celá dávka by měla být vyplněna doprovodným formulářem.

[44], [45], [46], [47]

Způsoby a frekvence vyšetření pacientů

Při počátečním, takzvaném diagnostickém vyšetření pacienta na tuberkulózu je nutné vyšetřit nejméně 3 části sputa po dobu 2 nebo 3 dnů. Shromážděné pod dohledem zdravotnického personálu, což zvyšuje účinnost mikroskopie.

Primární screening tuberkulózy by měl provádět všechny lékařské diagnostické instituce systému zdravotní péče. V poslední době byly na základě klinických diagnostických laboratoří organizovány takzvané mikroskopické centra vybavené moderními mikroskopy a zařízeními pro epidemiologickou bezpečnost, aby se zlepšila účinnost počátečního vyšetření.

V zařízeních proti tuberkulóze se používá screeningový test, který zahrnuje vyšetření sputa nebo jiný diagnostický materiál alespoň 3krát po dobu 3 dnů. Během léčby se mikrobiologické studie provádějí pravidelně alespoň jednou měsíčně během intenzivní fáze chemoterapie. Při přechodu na fázi léčby se studie provádějí méně často - s intervalem 2-3 měsíců, zatímco frekvence studie je snížena na dvě.

Charakteristika sbírky diagnostického materiálu pro extrapulmonární tuberkulózu

Feature patologický materiál s mimoplicní formy tuberkulózy - Mycobacterium tuberculosis nízké koncentraci v něm, což vyžaduje více citlivé způsoby mikrobiologických studií, a to především na secí techniky médiu.

U tuberkulózy močového měchýře je nejvhodnějším studijním materiálem moč. Sběr moči by měl provádět speciálně vyškolená zdravotní sestra.

Vnější genitálie se promyjí vodou mýdlem nebo slabým roztokem manganistanu draselného. Vnější otevírání močové trubice je pečlivě ošetřeno. Ve sterilní lahvičce se shromažďuje průměrná část ranního moči: u mužů, přirozeně u žen, s použitím katetru. Moč z ledvinné pánve se shromažďuje ve sterilních zkumavkách s katetrizací jedné nebo dvou ledvin, ve druhém případě - nutně odděleně od každé ledviny. Malé množství této moči se centrifuguje, sediment se zkoumá.

U mužů, spermií, bodkovaných varlat je tajemství prostaty podrobeno odstředění, aby se získala sraženina. Při lokalizaci specifického procesu v genitální oblasti u mužů může masáž prostaty podpořit sekreci sekrecí obsahujících mycobacterium tuberculosis.

Menstruační krev u žen se shromažďuje nasáním nebo použitím Kafka čepice. Získaný materiál se zbaví červených krvinek, promyje se destilovanou vodou a potom se centrifuguje. Sraženina se zkoumá.

Přidělení z cervikálního kanálu dělohy se odebírají v některých kapacitách Kafka nebo v čepici, to znamená, že je žádoucí akumulovat 1-2 ml patologického materiálu.

Materiál získaný z operativních zákroků na ledvinách, pohlavních orgánech. S biopsií, vyškrabáním z endometria, homogenizací. K tomu je umístěna ve sterilní maltě a důkladně rozdrcena sterilními nůžkami. K této suspenzi byl přidán sterilní říčního písku v množství, které odpovídá jeho hmotnosti, a pak doplnit s 0,5-1.0 ml izotonického roztoku chloridu sodného a vše se rozetře až pastovité hmoty s přídavkem isotonického roztoku chloridu sodného (4-5 ml). Pak se hmota nechá usadit po dobu 1 až 1,5 minuty, supernatant se zkoumá.

Tuberkulóza kostí a kloubů. Puncka (hnis z abscesů) získaná sterilní injekční stříkačkou je umístěna ve sterilních pokojích a okamžitě dodána do laboratoře. Sterilní pipeta, předtím zvlhčená sterilním izotonickým roztokem chloridu sodného, vezměte 2-5 ml hnisu, přeneste ji do lahvičky s perličkami a přidejte další 2-3 ml izotonického roztoku chloridu sodného. Láhev je uzavřena korku a protřepávána v žaludku po dobu 8-10 minut. Homogenizovaná suspenze se zkoumá.

U fistulózních forem osteoartikulární tuberkulózy se užívá hnis z píštěle. Zbylý výboj se shromažďuje přímo do zkumavky. V případech, štíhlé Pyorrhea píštěle promyje sterilním izotonickým roztokem chloridu sodného, a po promytí byly shromážděny do zkumavky, nebo kus tamponu impregnovaného hnisem zaslané pro analýzu.

Chirurgický materiál získaný během chirurgických zákroků na kostech a kloubech se může skládat z hnisavých nekrotických hmot, granulací, tkáně jizev, kostní tkáně, tkáně synoviální membrány a dalších substrátů. Jeho léčba je prováděna, stejně jako u tuberkulózy ledvin.

Mikrobiologická studie synoviální tekutiny ve 3% roztoku citronanu sodného (poměr 1: 1) k prevenci koagulace se provádí okamžitě po punkci.

Tuberkulóza lymfatických uzlin. Také se zkoumá hnis, extrahovaný při punkci lymfatických uzlin. Jako hnis z abscesů. Tkáně lymfatických uzlin získané během chirurgických zákroků, biopsie, jsou vyšetřovány stejně jako u jiných forem tuberkulózy.

Studium stolních hmot na mycobacterium tuberculosis je extrémně vzácné kvůli téměř úplnému nedostatku pozitivních výsledků.

[48], [49], [50], [51], [52], [53], [54], [55], [56], [57]

Mycobacterium microscopy

Mikroskopie sputa je poměrně rychlá, jednoduchá a levná metoda, která by měla být použita ve všech případech s podezřením na tuberkulózu. Kromě toho se tato studie provádí s cílem zhodnotit účinnost chemoterapie a zkontrolovat obnovení nebo selhání léčby, pokud neexistuje žádný test na kultivaci.

Používají se dvě metody mikroskopického vyšetření:

• metoda přímého mikroskopu, pokud se připraví přímo z diagnostického materiálu;
• metoda mikroskopie sedimentu připraveného z dekontaminačně upraveného materiálu pro kultivaci.

První metoda se používá v těch laboratořích, kde se provádějí pouze mikroskopické studie (klinické a diagnostické laboratoře obecné lékařské sítě).

Nejlepší výsledky mikroskopického vyšetření se získají koncentrací diagnostického materiálu (například centrifugací).

K detekci Mycobacterium tuberculosis s pravděpodobností 50% při provádění mikroskopie by měl 1 ml sputa obsahovat více než 5000 mikrobiálních buněk. Sputa pacientů s pulmonálními formami tuberkulózy obvykle obsahuje významné množství kyselých bakterií, které jim umožní spolehlivě detekovat bakterioskopií. Diagnostická citlivost této metody může být zlepšena vyšetřením několika vzorků sputa od jednoho pacienta. Negativní výsledek bakterioskopického vyšetření nevylučuje diagnózu tuberkulózy, jelikož sputa některých pacientů obsahuje méně mykobakterií, než je možné detekovat pomocí mikroskopie. Špatná příprava skvrny sputa může také způsobit negativní výsledek bakterioskopického vyšetření.

Nejběžnější metodou pro detekci kyselých-rychlých mykobakterií v nátěru je barva podle Tsiol-Nelsena. Způsob je založen na pronikání karbolického fuchsinu do mikrobiální buňky přes membránu, která obsahuje vrstvu voskovitých lipidů a současně zahřívá a silně leptá fenol. Následné zbarvení nátěru s 25% roztokem kyseliny sírové nebo 3% kyseliny chlorovodíkové vede k zbarvení všech nekyselých struktur. Zbarvené prvky nátěru jsou obarveny 0,3% roztokem methylenové modři. Mykobakterie nevnímají obvyklé anilinové barviva, v důsledku čehož jsou kyselé rychlé mykobakterie zbarvené karmínově červenou a další mikroby a buněčné elementy - modře.

Pro nátěrech obarvených Ziehl-Nelsenu pomocí světelného binokulárního mikroskopu s olejovým objektivem (90- nebo 100-násobné zvýšení) a okulárem na zvětšení 7- nebo 10-násobné. Prozkoumejte 100 zorných polí, které stačí k identifikaci jednotlivých mykobakterií v nátěru. V případě, že výsledek takové studie je negativní, pro potvrzení se doporučuje zobrazit dalších 200 zorných polí. Zaznamenejte výsledky s uvedením počtu zjištěných kyslíkových bacilů (KUM).

Kromě této techniky se pro luminiscenční mikroskopii používají barevné fluorochromy, které umožňují dosažení nejlepších výsledků. Použití této metody zvyšuje účinnost mikroskopie o 10-15%. Při léčbě mykobakterií pomocí luminiscenčních barviv (auramin, rodamín atd.) Se tyto látky také váží na voskovité struktury mikrobiální buňky. Při ozařování barevných buněk s vzrušujícím světelným zdrojem (určité spektrum ultrafialového záření) začnou svítit oranžové nebo jasně červené světlo na černém nebo tmavě zeleném pozadí. Vzhledem k vysokému jasu a kontrastu viditelného obrazu může být celkové zvětšení mikroskopu sníženo o 4 až 10krát, zvětšení zorného pole a doba zobrazení přípravku klesá. Spolu s tím, díky mnohem větší hloubce ostrosti, můžete zvýšit pohodlí studia.

Při použití fluorescenční mikroskopie ke sledování stejné oblasti skvrnu stráví podstatně kratší dobu, než za světelném mikroskopu stěrech obarvených Ziehl-Nelsenu. Pokud za jeden pracovní den mikroskop zkoumá asi 20-25 takovýchto skvrn, pak pomocí fluorescenční mikroskopie může zkoumat více než 60-80 vzorků najednou. Zkušený microscopist vědí, že barva buněk se směsí Auramin a rhodamin je poněkud specifická pro acidorezistentní bacily, které v tomto případě jsou zlaté pruty. Saprofyty jsou malované nazelenalou barvou.

Další důležitou výhodou způsobu fluorescenční mikroskopie - schopnost detekovat změněné Mycobacterium, ztratil pod vlivem nepříznivých faktorů, včetně intenzivní chemoterapie, kislotousotoychivosti majetku a v souvislosti s tímto barvením Ziehl-Nelsenu není detekován.

Nevýhodou metody fluorescenční mikroskopie je poměrně vysoká cena mikroskopu a jeho provoz. V centralizovaných nebo jiných velkých laboratořích, kde zátěž překračuje normu tří laboratorních techniků pracujících se třemi konvenčními mikroskopymi, je levnější použít místo toho jeden fluorescenční mikroskop.

Bakterioskopické metody mají spíše vysokou specificitu (89-100%). Asi 97% pozitivních výsledků získaných jakoukoli metodou mikroskopie jednoznačně potvrzují výsledky výsevu.

Je třeba poznamenat, že při mikroskopickém vyšetření nátěru patologického materiálu není možné určit druh patřičný k identifikaci kyselých rychlých mykobakterií. Způsob mikroskopie umožňuje, aby se vyjádřil pouze na přítomnosti nebo nepřítomnosti kyseliny v přípravě mikroorganizmů, což lze vysvětlit existencí v přírodě z velkého počtu morfologicky podobné tuberkulózou mykobakterií komplexní mikroorganismů rezistentních kyselin nontubercular.

Výsledky mikroskopie jsou vyhodnocovány v semikvantitativních jednotkách.

Aby bylo možné porovnat výsledky různých metod mikroskopie, jsou zavedeny empirické koeficienty. Například, porovnat výsledky nátěrech obarvených s fluorescenčními barvivy, data výzkum světelný mikroskop (1000 násobné zvětšení), je nutné rozdělit počet acidorezistentní bacily detekována fluorescenčním mikroskopem, odpovídající koeficient při 250-násobném zvětšení, - až 10, 450krát - na 4, 630krát - na 2.

Vlastnosti mikroskopie pro extrapulmonární tuberkulózu

Vykonává se přímá mikroskopie, stejně jako mikroskopie nátěrů připravených po obohacení, následovaná barvením Tsiol-Nelsen nebo luminiscenčními barvivy. Přímá mikroskopie nátěrů je neúčinná kvůli nízké koncentraci mykobakterií v materiálu, a proto je racionálnější používat metody obohacování. Nejúčinnější je odstřeďování. V případě, že biologický materiál je viskózní, centrifugace se nanáší současným zkapalňování a homogenizace materiálu, který se provádí za použití vysokorychlostních odstředivek s odstředivou silou 3000 g a roztoky chlornanu. Jiné způsoby obohacování, jako je například mikro flotace, se v současné době nepoužívají kvůli vzniku biologicky nebezpečných aerosolů.

[58], [59], [60], [61], [62]

Kulturní metoda diagnostiky tuberkulózy

Způsob výsevu nebo metoda kultivace je citlivější než mikroskopie na rozmazání a má řadu výhod oproti této mikroskopii. Umožňuje detekovat několik desítky životaschopných mykobakterií v testovacím materiálu a má velkou diagnostickou hodnotu. To je zvláště důležité při vyšetření materiálu od nově diagnostikovaných nebo léčených pacientů, kteří uvolňují malé množství mykobakterií.

V porovnání s mikroskopií umožňuje výzkum v oblasti kultury zvýšit počet pacientů s TB diagnostikovaných o více než 15-25%, stejně jako ověření tuberkulózy v raných fázích, kdy je onemocnění stále léčitelné. Velmi důležitou výhodou kultivačního testu je možnost získat kulturu buňky, která může být identifikována a studována s ohledem na citlivost vůči lékům, virulenci a jiné biologické vlastnosti.

Nevýhody způsobů kultivace zahrnují jejich trvání (čekací doba materiálů dosahuje 10 týdnů). Vyšší náklady, složitost zpracování diagnostického materiálu.

Principy předběžné léčby diagnostického materiálu

Konvenční mikrobiologické metody nelze použít při provádění studií o tuberkulóze. To je dáno skutečností. že mycobacterium tuberculosis roste velmi pomalu a většina klinických vzorků obsahuje rychle rostoucí pyogenní a hnilobné mikroorganismy, houby. Jejich rychlý růst na bohatých živných médiích interferuje s vývojem mykobakterií a neumožňuje izolaci vyvolávajícího tuberkulózy, takže diagnostický materiál musí být před ošetřením předem ošetřen. Kromě toho jsou mykobakterie uvolněné z dýchacích cest pacienta obvykle obklopeny velkým množstvím hlenu, což ztěžuje jejich koncentraci. V tomto ohledu je nutné před vypálením sputu a dalších podobných materiálů, jejich zkapalnění, dekontaminace.

Všechny detergenty a dekontaminy mají více či méně výrazný toxický účinek na mykobakterie. V důsledku zpracování může zemřít až 90% mykobakterií. Pro udržení dostatečného množství mykobakteriální populace, šetřící potřebu použití technik zpracování, které umožňují, na jedné straně, k potlačení rychle rostoucí pyogenní bakterie a zkažený, a na druhé straně - aby se zachovala životaschopnost mykobakterií přítomných v materiálu.

V závislosti na materiálu, jeho stupeň homogenity a znečištění pro předzpracování pomocí různých dekontaminační: sputum - 4% roztoku hydroxidu sodného, roztoky trohzameschonnogo fosforečnan sodný 10%, benzalkoniumchlorid, fosforečnan sodný, NALC-NaOH (N-acetyl-L-cysteinu hydroxidu sodného) v konečné koncentraci 1% roztoku hydroxidu sodného, v moči a jiných kapalných látek - roztoku kyseliny sírové 3%, pro kontaminované vzorky, materiály obsahující tuk - roztok kyseliny oxalové, přičemž se 5%. Kromě toho se v některých případech používají enzymy, povrchově aktivní látky (detergenty). Aplikační Tween detergenty a jiné mykobakteriální smrt provází méně buňkách (40-50% přežít). Mohou však být použity pouze pro tekuté materiály. Největší distribucí na světě byla NALC-NaOH. Vyrobené v souborech. Tato metoda umožňuje přidělit více než 85% populace mykobakteriálních buněk. Dekontaminační tkanesoderzhaschih pevné látky těžší odhadnout, protože stupeň disperze materiálu během homogenizace obtížné. Například biopsie léčba lymfatických uzlin je často doprovázena zvýšenou frekvencí kontaminace cizími flóry. V tomto případě lze použít 1% etonia.

Nehomogenní materiál se homogenizuje skleněnými kuličkami za přítomnosti dekontaminantů. Kapalné materiály se před centrifugují a zpracuje se pouze sraženina.

Secí a inkubační techniky

Po předúpravě se materiál centrifuguje, čímž se vysráží mykobakterie a zvyšuje se jejich obsah v sedimentu ("obohacování kalu"). Výsledná sraženina se neutralizuje a inokuluje (naočkuje) hustým živným médiem nebo zkumavkami s kapalnými (polokapalnými) médii. Ze zbytku sedimentu jsou připraveny nátěry pro mikroskopické vyšetření. Technika očkování by měla zabránit křížové kontaminaci diagnostického materiálu.

Pro spolehlivou klinickou interpretaci výsledků mikrobiologické studie je třeba dodržet následující pravidlo: mikroskopické studie a studie o kultuře musí být provedeny paralelně ze stejného vzorku diagnostického materiálu.

Inokulované trubice jsou umístěny v termostatu při teplotě 37 ^° C po dobu 2 dnů ve vodorovné poloze. To zajišťuje rovnoměrnější absorpci materiálu do kultivačního média. Po 2 dnech se trubice přemístí do svislé polohy a hermeticky utěsní gumovou nebo silikonovou zátkou, aby se zabránilo usušení zasetého média.

Plodiny se inkubují při 37 ° C ^o C po dobu 10-12 týdnů s pravidelným týdenním zobrazení. Pro každý náhled jsou zaznamenány následující parametry:

• doba vizuálně pozorovaná ode dne výsevu;
• míra růstu (počet CFU);
• kontaminace plodiny cizí mikrobiální flórou nebo houbami (tyto trubice jsou odstraněny);
• nedostatek viditelného růstu. Trubky jsou ponechány v termostatu až do dalšího prohlížení.

Živné médium

Pro kultivaci mykobakterií se používají různá živná média; hustá, polotekutá, kapalná. Avšak žádné ze známých živných médií nemá vlastnosti, které zajišťují růst všech mykobakteriálních buněk. V souvislosti s tím se doporučuje používat 2-3 živné látky různého složení, aby se zvýšila jejich účinnost.

WHO doporučuje prostředí Levenstein-Jensen jako standardní médium pro primární izolaci původců tuberkulózy a pro stanovení její citlivosti na léky. Jedná se o prostředí s hustým vajíčkem, na němž je růst mykobakterií dosažen 20. Až 25. Den po naočkování bakterioskopicky pozitivního materiálu. Plodiny bakterioskopicky negativního materiálu vyžadují delší inkubační dobu (až 10-12 týdnů).

V naší zemi navrhovaná E.R. Finské vaječné prostředí Finn-II. To se liší tím, že místo L-asparaginu používá glutamát sodný, který spouští jiné způsoby syntézy aminokyselin mykobakterií. Růst se na tomto médiu objevuje poněkud dříve a frekvence přidělení mykobakterií je o 6-8% vyšší než v médiu Lowenstein-Jensen.

Pro zlepšení účinnosti bakteriologické diagnostiky extrapulmonární tuberkulózy je vhodné zahrnout modifikované médium Finn-II do komplexu živných médií. Pro urychlení růstu se do živného média Finn-II dodatečně přidá 0,05% thioglykolátu sodného, který snižuje koncentraci kyslíku. Pro ochranu enzymu z Mycobacterium systémů toxických produktů peroxidace lipidů v živném médiu Finn-II podávat antioxidační α-tokoferol acetátu v koncentraci 0,001 ug / ml. Očkování diagnostického materiálu se provádí standardním postupem.

V ruských laboratořích proti tuberkulóze se také používají další modifikace hustých živných médií; navrhl G.G. Mordovské živné médium "New" vyvinuté firmou V.A. Anicická živná média A-6 a A-9 atd.

Vzhledem k tomu, že v procesu chemoterapie je poškození na různé metabolické systémy mikrobiálních buněk, některé mykobakteriální populace ztrácí schopnost vyvinout normálně v běžném živném médiu a vyžaduje osmoticky vyvážené (nebo polotekuté) kultivačního média.

Hodnocení a zaznamenávání výsledků očkování diagnostického materiálu

Některé kmeny a druhy mykobakterií rostou pomalu, růst se může objevit až do 90. Dne. Počet těchto plodin je malý, což však umožňuje odolat plodinám v termostatu po dobu 2,5-3 měsíců.

Virulentní kultury mycobacterium tuberculosis obvykle rostou v prostředí s hustým vajíčkem ve formě R-kolonií různých velikostí a druhů. Kolonie jsou suché, vrásčité, slonovinové, mírně pigmentované. V jiných médiích může být kolonie mycobacterium tuberculosis vlhčí. Po ukončení chemoterapie nebo během léčby mohou být přiděleny hladké kolonie s vlhkým růstem (S-formy).

Při izolaci plodin je použita sada speciálních studií k odlišení mycobacterium tuberculosis od netuberkulózních mykobakterií a kyselých rezistentních saprofytů.

Pozitivní reakce je dána po povinném mikroskopickém vyšetření zafarbeného nátěru Tsiol-Nelsen z rostoucích kolonií. V případě růstu mykobakterií v nálitcích jsou nalezeny jasně červené tyčinky, které ležou jednotlivě nebo ve skupinách tvořících klastry ve formě plsti nebo copánků. U mladých kulturách, zejména izolovaných z dlouhodobé léčby pacientů s chemoterapií, mykobakterie liší exprimovaný polymorfismus, až přítomnosti tyče ve tvaru, spolu s krátkými, téměř kokovitý nebo prodloužených verzí, které se podobají mycelium.

Rychlost růstu mykobakterií je indikována následujícím schématem: (+) - 1-20 cfu in vitro (málo vylučované bakterie); (++) - 20-100 CFU in vitro (mírné vylučování bakterií); (+++) -> 100 CFU in vitro (bohaté vylučování bakterií). Při laboratorní diagnostice tuberkulózy nestačí odpovědět na to, zda je mykobakterium detekováno jednou nebo jinou metodou. Mít podrobné pochopení rozsahu a povahy mykobakteriální populace, jejího složení a vlastností. Právě tyto údaje nám umožňují správně interpretovat stav procesu, naplánovat taktiku a včas upravit léčbu.

V posledních letech bylo navrženo urychlit růst mykobakterií, navrhnout živné prostředí na bázi agaru s různými přísadami růstu a použití speciální směsi plynů. Pro získání růstu mykobakterií na těchto médiích vzniká během kultivace atmosféra s vysokým obsahem oxidu uhličitého (4-7%). Pro tento účel se používají speciální inkubátory CO ₂. Nejrozvinutější automatizované systémy pro kultivaci mykobakterií: MGIT-BACTEC-960 a MB / Bact.

Jeden takový systém - MGIT systém (růst mykobakterií označující trubka), který se odkazuje na vývoj špičkových technologií a je určen pro rychlou bakteriologickou diagnostiku tuberkulózy a Mycobacterium náchylnosti k první linie léků, a některé léky druhé řady. MGIT je zaměřen na jeho použití jako součást zařízení VASTES-960. Mikroorganismy se kultivují ve speciálních zkumavkách s kapalným živným médiem založeným na modifikovaném médiu Middlebrook-7H9. Pro stimulaci růstu mykobakterií a potlačení růstu cizí mikroflóry se používá MGIT růstový doplněk a směs antibakteriálních léčiv PANTA.

Růst mikroorganismů se zaznamenává opticky. Je založen na fluorescenci, k níž dochází při spotřebování kyslíku mykobakteriemi během růstu. Fluorescenční barvivo závislé na kyslíku se nachází na spodní straně speciální zkumavky a je pokryto vrstvou silikonu. Reprodukce mykobakterie vede ke snížení množství kyslíku v trubici a snížení koncentrace, která způsobuje zvýšení fluorescence, která se stává viditelný za ozařování ultrafialovým světlem trubky a automaticky registrován fotosenzor vestavný spotřebič VASTES-960. Intenzita luminiscence se zaznamenává v jednotkách růstu (jednotky růstu GU). Údaje o růstu jsou zaznamenávány v počítači, kde mohou být automaticky uloženy. Počítačová analýza růstových křivek může poskytnout informace o přítomnosti různých Mycobacterium bazénů, včetně nontubercular, a také pomáhá vyhodnotit vlastnosti růstu mykobakterií.

V důsledku zavádění takových systémů se výrazně snížil čas růstu mykobakterií, průměrně 11 dní na VASTES-960 a 19 dní na MB / Bact versus 33 dní na standardním hustém živném médiu. Je třeba poznamenat, že tyto systémy vyžadují vysoce kvalifikovaný personál. Vysekávání materiálu na kapalné médium je nezbytně doprovázeno zasetím na médium Levenstein-Jensen, které hraje roli zálohování v těch případech, kdy mycobacterium tuberculosis nevyvolává vznik jiných médií.

[63], [64], [65], [66], [67], [68], [69], [70], [71]

Stanovení citlivosti mykobakterií na léky

Stanovení spektra a stupně citlivosti mykobakterií na léky proti tuberkulóze má velký klinický význam, stejně jako epidemiologické hodnocení šíření tuberkulózy s rezistencí na léky. Navíc monitorování rezistence na léčiva umožňuje posoudit účinnost programu tuberkulózy jako celku, což je integrálním ukazatelem výkonnosti všech složek činností proti tuberkulóze.

Mnohočetnost a načasování citlivosti na léky:

• před zahájením léčby jednou pro stanovení strategie a taktiky léčby:
• pokud jsou izolovány z nemocných kultur z různých materiálů (sputa, tekutina BAL, moč, výpotky, tekutina apod.), jsou zkoumány všechny izolované kmeny:
• na konci intenzivní fáze léčby bez klinické a radiologické dynamiky:
• pokud je nutné změnit režim léčby v následujících případech:
  • absence skvrny sputu;
  • re-izolace kultury po negativním rozpadu sputa;
  • drastické zvýšení počtu CMU v tamponu po počátečním poklesu. Je dobře známo, že kmeny mycobacterium tuberculosis, které jsou heterogenní z hlediska citlivosti na léky, jsou izolovány od materiálu od pacienta s tuberkulózou. Citlivost kmenů na léky proti tuberkulóze se může lišit v rozmezí léků, stupně, frekvence a rychlosti výskytu rezistence.

Stupeň lékové rezistence Mycobacterium tuberculosis byla stanovena v souladu se stanovenými kritérii, které jsou zaměřeny na klinický význam a stabilita závisí na aktivitě anti-TB léku, jeho farmakokinetiku, koncentrace v lézi. Maximální terapeutická dávka a tak dále.

Stanovení citlivosti mykobakterií na léky se v současné době provádí mikrobiologickými metodami:

• Absolutní koncentrace (metoda ředění na hustém nebo kapalném živném médiu),
• rozměry,
• koeficient odporu.

Obvykle stabilita projevuje vizuálně pozorovatelný růst kolonií Mycobacterium tuberculosis, ale existují techniky, které indukují časná stadia růstu v dělících se buňkách Mycobacterium ve formě barevné reakce. Tyto metody zkracují zkušební čas z 3-4 na 2 týdny.

Jak je sjednocena v Rusku byla prodloužena, doporučuje chemoterapie metodou WHO výboru absolutních koncentrací, což je z metodického hlediska, je nejjednodušší, ale vyžaduje vysokou přesnost a standardizace laboratorních postupů. Test citlivosti na léky se skládá ze souboru testovacích zkumavek se živným médiem modifikovaným anti-TB léky. Souprava se skládá z 2-3 trubek s různými koncentracemi každého z léčiv používá, jedna řídicí trubky bez léku na životní prostředí a jedna zkumavka obsahující 1000 mcg / ml sodného Sali tsilovokislogo nebo 500 ug / ml paranitrobenzoynoy kyselina nontubercular pro detekci růstu mykobakterií.

Pro přípravu sady médií s přípravky se použije modifikované médium Levenstein-Jensen (bez škrobu), které se nalije do baňek. V každé baňce se přidá specifický objem vhodného ředění antituberkulózního přípravku. Obsah baňky se důkladně promíchá, nalije do zkumavek a skládá se ve skloněné poloze po dobu 40 minut při teplotě 85 ° C. Doporučuje se, aby se médium stočilo v elektrickém převíječi s automatickým řízením teploty. Ve středu s léky proti TBC

1. řada může být uchovávána v chladničce při 2-4 ° C po dobu 1 měsíce, s přípravky druhé řady - ne více než 2 týdny. Skladování médií s přípravky při pokojové teplotě je nepřijatelné. Při přípravě roztoků léků proti tuberkulóze se brát v úvahu jejich aktivita, výpočet koncentrace upravené o molekulovou hmotnost nespecifické části přípravku, čistotu atd. K určení citlivosti na léky se používají pouze chemicky čisté látky.

Principem metody je stanovení koncentrace antituberkulózního léčiva, které inhibuje růst významné části mykobakteriální populace. Pokud je provedena správně, má tato metoda dobrou spolehlivost.

Před testem je nutné zajistit, aby izolovaná kultura mycobacterium tuberculosis neměla cizí mikroflóru. Z kultivace mykobakterií v 0,9% roztoku chloridu sodného se připraví homogenní suspenze obsahující 500 milionů mikrobiálních tělísek na ml (standard optického zákalu 5 jednotek). Výsledná suspenze se zředí 0,9% roztokem chloridu sodného (1:10) a 0,2 ml kaše se přidá do každé zkumavky sady kultivačních médií. Očkované Zkumavky byly umístěny do inkubátoru při teplotě 37 ° C a udržuje se ve vodorovné poloze po dobu 2-3 dnů na šikmé ploše média byla rovnoměrně inokulují suspenzí Mycobacterium tuberculosis. Trubky jsou pak přeneseny do svislé polohy a inkubovány po dobu 3-4 týdnů. Výsledky jsou zaznamenány po 3-4 týdnech.

Vzhledem k tomu, načasování uvolňování látky z klinického materiálu na živném médiu tvoří nejméně 1-1,5 měsíce lékové citlivosti mohou být získány tímto způsobem, je ne dříve než po 2-2,5 měsíce po očkovacího materiálu. To je jeden z hlavních nedostatků metody.

Interpretujte výsledky stanovení citlivosti mykobakterií na léky na základě určitých kritérií. Na pevném kultivačním médiu se za citlivé na koncentraci léku, který je obsažen v médiu, v případě, že počet kolonií mykobakterií pěstovaných in vitro s tímto léčivem nečiní více než 20 s bohatým růstem v kontrolní zkumavky bez léčiva. Pouze v přítomnosti více než 20 kolonií je kultura považována za odolnou vůči této koncentraci. V praxi při získávání výsledků růstu ve zkumavkách blížících se 20 cfu. Je nutné upozornit klinickou jednotku, že citlivost nebo odpor je v tomto případě hraniční, neboť někdy může vysvětlit fuzzy dynamiku klinických indikátorů.

U různých léků je stanovena určitá koncentrace, při které je pozorována reprodukce kritického podílu mykobakteriální populace. Tyto koncentrace se nazývají "kritické". Jako kritérium stability se používá růst populace mykobakterií na živném médiu s přípravkem v kritické koncentraci.

V domácí praxi TB se při stanovení rezistence vůči léku neomezují pouze na stanovení kritických koncentrací. To je dáno skutečností. že rozšířená úroveň definice lékové rezistence umožňuje lékař přesněji polohy taktiku chemoterapie s použitím znalosti potenciace účinku lékových kombinací, křížem krážem očekávaný odpor nebo použít účinnější léky skupina použita anti-TB léčivy.

Metoda absolutní koncentrace je nejjednodušší, ale je také nejcitlivější na chyby, které se při provádění provedou. Spolehlivější, zvláště při určování citlivosti na druhé linie léčiv a obvyklé mimo Rusko, je metoda proporcí. Bere v úvahu nedostatky metody absolutních koncentrací, ale při provádění je pracnější.

Metoda je velmi podobná metodě absolutní koncentrace. Příprava testovacích zkumavek s léky se provádí stejným způsobem. Jako v absolutní koncentrační metodě. Dávka semena suspenze mykobakterie tuberculosis je však snížena o faktor 10. Což eliminuje frekvenci spontánní rezistence některých kmenů mykobakterie tuberculosis na takové léky, jako je Etambutol, protionamid, kapreomycin. Jako kontrola se použijí 2 nebo 3 zkumavky se stejnou dávkou semen v testovacích zkumavkách, postupně zředěné 10 a 100 krát. Kritériem stability je podíl vizuálně pozorovaného růstu mykobakterie tuberculosis. U léků 1. Série je kritériem stability přebytek růstu 1% počáteční populace, u léčivých přípravků druhé řady - zvýšení o 1 nebo více než 10% počátečního, v závislosti na zvolené kritické koncentraci.

V roce 1997 pracovní skupina Světové zdravotnické organizace a Mezinárodní unie pro identifikaci dobré tuberkulózy odporu TB drogy učinil úpravy těchto kritérií, které nabízejí za rezistentní mykobakterie, které nerostou na pevný vaječný média Lowenstein-Jensen v následujících koncentracích:

• dihydrostreptomycin - 4 μg / ml;
• isoniazid 0,2 μg / ml:
• rifampicin 40 μg / ml:
• Ethambutol - 2 μg / ml.

V roce 2001 byly navrženy kritické koncentrace pro následující léky druhé řady (pro kritický podíl 1%):

• capreomycin - 40 mcg / ml;
• protionamid - 40 mcg / ml;
• kanamycin - 30 μg / ml;
• viomycin - 30 mcg / ml;
• cykloserin 40 μg / ml;
• kyselina aminosalicylová - 0,5 μg / ml;
• ofloxacin - 2 μg / ml.

Výsledky růstu jsou vyhodnoceny po 4 týdnech předběžné a po 6 týdnech kultivace - jako poslední.

Pro stanovení citlivosti léku na pyrazinamid, který se v moderní chemoterapii pro tuberkulózu široce používá, doporučená kritická koncentrace je 200 μg / ml. Nicméně, stále ještě neexistuje všeobecně přijímaný způsob stanovení odolnosti proti této drogy na pevných živných půdách, protože jeho antibakteriální účinnost se projevuje jen v kyselém prostředí (pH <6), která je technicky obtížné udržet. Kromě toho mnoho klinických kultur mykobakterií tuberkulózy neochotně rostou v prostředí vajec s kyselým prostředím.

Pro hodnocení kvality výsledků lék testování citlivosti Mycobacterium, doporučuje, aby každá nová várka střední LJ ovládat paralelní stanovení citlivosti standardní muzea kmene H37Rv. Kromě toho existují určité mikrobiologické kritéria, které musí být zachovány, aby techniky daly dobře reprodukovatelný a správně interpretovaný výsledek. Mezi ně patří životaschopnost kultury Mycobacterium tuberculosis, pravidla pro získání homogenní suspenze a suspenzní kultury výběrových pravidel Mycobacterium tuberculosis, reprezentativnosti vybraného bakteriální hmoty. Spolehlivost stanovení rezistence na léky se s extrémně vzácným uvolňováním bakterií snižuje.

Nedávno byla metoda pro stanovení citlivosti na léky pomocí automatizovaných systémů považována za slibnou. Nejdokonalejší v této oblasti jsou vývoje založené na VASTES MGIT-960. V tomto případě je citlivost mykobakterie tuberculosis na léky stanovena na základě modifikované metody proporcí. V procesu stanovení se porovnává rychlost růstu mykobakterie tuberkulózy v kontrolní zkumavce a ve zkumavkách s léčivy. Pro stanovení citlivosti na streptomycin, isoniazid, útes-pitsinu a ethambutolu se používají obohacující přísady a antibiotika součástí sady SIRE sadě. K určení citlivosti na pyrazinamid použijte sadu PZA. V průběhu Zkouška suspenze Mycobacterium tuberculosis naočkují zkumavky s léky, jakož i kontrolních obrazovek s rekonstituovanou suspenzí 100x pro všechny léky kromě pyrazinamidu, kde suspenze je ředění 10x. Kritérium stability je mykobakterií indikátoru Růst hodnota 100 GU, když je růst v kontrolní zkumavky 400 GU (cm „Kultura izolace mykobakterií metody“). Účetnictví a interpretace výsledků se provádějí automaticky a jsou nastaveny na vstupu nebo zvoleném programu.

Jako kritické koncentrace se konečná koncentrace použije ve zkumavce s tekutým živným médiem. V současné době byly vyvinuty kritické koncentrace jak pro léčivé přípravky první linky, tak pro léky druhé řady. Je třeba poznamenat, že citlivost mykobakterií tuberkulózy na cycloserin a kyselinu aminosalicylovou je určena pouze na živných médiích ve vajíčku.

Komplikované pracovní protokol popsán systém umožňuje studovat citlivosti vůči léčivům jako vyhrazené kultury (hustá živném médiu), a pomocí primárního Mycobacterium MGIT-růst in vitro. Druhá možnost významně snižuje čas na kulturu, která vám umožní získat úplné výsledky kultury Mycobacterium tuberculosis (včetně informací o citlivosti na léky) po 3 týdnech od data odběru materiálu, zatímco tradiční metoda je možné získat pouze třetí měsíc. Časem získané výsledky, kdy je pacient v intenzivní fázi léčby, mohou kompenzovat poměrně vysoké náklady na výzkum.

[72], [73], [74], [75], [76], [77], [78], [79]

Diferenciace mykobakterií

Vzhledem k tomu, že použité živné médium není přísně selektivní. Následná diferenciace izolovaných mykobakterií je uznána jako povinná. Potřeba diferenciaci mykobakterií je vzhledem k množství vlastností patologických procesů způsobených rodu: odlišný průběh a výsledek tuberkulózy a mykobakteriózy, přítomnost rezistence přírodní léčiva pro některé anti-TB léčivy.

Je známo, že primární identifikace Mycobacterium komplexu M. Tuberculosis nontubercular z mykobakterií se provádí pomocí následujících charakteristik: rychlost růstu na pevných živných médií, pigmentace, morfologie kolonií, za přítomnosti kyselého rezistence a teploty optimální růst.

Současnosti neexistuje jediná metoda laboratorní spolehlivě rozlišit komplexu M. Tuberculosis mykobakterie z jiných acidorezistentní bacily, nicméně kombinace vlastností popsaných výše s výsledky uvedenými dále z řady biochemických testů umožňuje identifikaci Mycobacterium tuberculosis komplex s M. Pravděpodobné, že 95%.

Pro odlišení Mycobacterium komplexu M. Tuberculosis (M. Tuberculosis, M. Bovis, M. BovisBCG, M. Africanum, M. Microti, M. Canettii a další) z pomalu rostoucí mykobakterie použité nontubercular základní biochemické testy, které detekují přítomnost následujících příznaků:

• schopnost produkovat kyselinu nikotinovou (niacinový test):
• aktivitu nitrátové reduktázy;
• termostabilní katalasa;
• růst na mediu se salicylátem sodným (1 mg / ml).

Jako další testy lze rovněž použít růst na médiu obsahujícím 500 ug / ml kyseliny paranitrobenzoové nebo 5% chloridu sodného.

Mnoho bakteriologických laboratoří tyto mikroorganismy identifikuje pouze na úrovni komplexu, což je způsobeno omezenými možnostmi laboratoří a metodickými schopnostmi odborníků.

Ve většině případů se však v praxi pro odlišení M. Tuberculosis a M. Bovis je dostatečná následující zkoušky: niacin, na přítomnost dusičnanů, registrace přítomnosti a pirazinamidazy růstu v médiu obsahujícím 2 ug / ml hydrazid thiofen-2-karboxylové kyseliny. Je třeba vzít v úvahu, že mykobakterie komplexu M. Tuberculosis jsou charakterizovány následující sadou znaků:

• pomalý růst (více než 3 týdny);
• růstová teplota v rozmezí 35-37 ^o C;
• absence pigmentace (slonoviny);
• výrazně kyselé barvy;
• pozitivní niacinový test;
• pozitivní test nitrátové reduktázy;
• nepřítomnost termostabilní katalázy (68 ^° C).
• Absence růstu na médiu Levenstein-Jensen obsahující:
  • 1000 μg / ml salicylátu sodného,
  • 500 μg / ml kyseliny paranitrobenzoové,
  • 5% chloridu sodného:
• růst v přítomnosti 1-5 ug / ml thiofen-2-karboxylové kyseliny.

Význam diferenciace izolovaných mykobakterií se výrazně zvýší zvýšením frekvence zaznamenávání případů HIV / AIDS souvisejících s tuberkulózou nebo mykobakteriózou. V současné době neexistuje absolutní jistota připravenosti praktických regionálních laboratoří správně provádět tento objem práce.

[80], [81], [82], [83], [84], [85], [86], [87], [88]

Imunologická diagnostika tuberkulózy

Existuje celá řada univerzálních jevů, léků a imunologických testů, které byly původně nalezeny přesně s tuberkulózou nebo na modelu imunitní odpovědi na mykobakterie. Patří mezi BCG tuberkulinu, takový jev jako kožní DTH (tuberkulinu - Pirquet a Mantoux reakce), v reakci na podkožní tuberkulinových senzibilizovaných zvířat (Koch jev). Jedna z prvních protilátek u infekčních onemocnění byla také zjištěna při tuberkulóze. Samozřejmě, že hlubší porozumění dobré mechanismy tuberkulózy imunitních a jejich genetické kontroly, tím větší může být použití imunologických metod a léků, které mají vliv na imunitní systém, řešit praktické problémy TB.

Nejdůležitějším a nejsložitějším praktickým problémem je v současnosti zjišťování tuberkulózy v procesu hromadného screeningu obyvatelstva. Nicméně, i přes četné zprávy o "úspěších" (na omezeném materiálu), neexistuje žádná vhodná imunologická metoda (reprodukovatelná v "žádné zbrani") a léku.

Imunologické metody, zejména sérologické studie (stanovení antigenů, protilátek) a testy provokující tuberkuliny, jsou v klinické praxi velmi rozšířené.

V první řadě mezi imunologickými studiemi používanými v diferenciální diagnostice jsou serologické metody - stanovení antigenů a protilátek v různých prostředích těla.

Specificita protilátek proti tuberkulóze mykobakterií závisí na antigenu použitém v imunotestu. Je navrženo významné množství antigenů, z nichž první je tuberkulin PPD:

• PAP a dalších komplexních přípravků z kultivační kapaliny;
• ultrazvuková dezintegrace;
• Extrakt z tritonu a další komplexní přípravky buněčných stěn;
• 5-antigen (Daniel);
• 60-antigen (Coccito);
• lipoarabinomannan;
• šňůrový faktor (trehalóza-6,6-di-mykolát);
• fenolické a jiné glykolipidy;
• lipopolysacharidy;
• antigen vázající fibronektin;
• proteiny (nejčastěji rekombinantní); 81,65,38,34,30,19,18,16,15,12 CDA atd.

V důsledku let výzkumu ruských a zahraničních vědců odhalily základní zákony a účinnost protilátky sérologickou diagnózu tuberkulózy: složitější antigenu je vyšší citlivost a nižší specificitu testu. Specifičnost v různých zemích, se liší v závislosti na počtu obyvatel infekce M. Tuberculosis a nontubercular mykobakterií z nesoucí BCG vakcinaci a další. U dětí, informační obsah serodiagnosis je nižší než u dospělých. U primární tuberkulózy (častěji u dětí) je definice IgM mnohem informativní. Se sekundární IgG. U pacientů infikovaných HIV se snižuje informativní hodnota sérologické diagnózy při stanovení protilátek. Stanovení účinnosti protilátek je závislá na počtu „klinických aspektů“: Proces aktivita (přítomnost nebo nepřítomnost „izolace“ mykobakterií přítomnost rozpadu dutin, je stupeň infiltrace), prevalence procesu, trvání jeho toku.

Citlivost metody enzymového imunotestu (ELISA) je přibližně 70%. Nedostatečná účinnost studie je způsobena nízkou specifičností. Dříve byla zvážena možnost použití sérologického screeningu u vysoce rizikových skupin, zejména u osob s posttuberkulózními změnami v plicích.

Ke zvýšení specifičnosti testu ELISA pokračují hledání specifických antigenů, včetně těch, které byly získány genetickým inženýrstvím: ESAT-6 atd. (Viz výše). Použití přísně specifických antigenů (38 kDa, ESAT) zvyšuje specifičnost. Ale výrazně snižuje citlivost analýzy. Spolu s IFA (zkušebních systémů experimentální laboratoře. Např Pathozyme ELISA kit) také poskytuje sady s bočním imunochromatografickým filtrací (Mycodot), stejně jako jiné podobné testy (dot-analýza na membráně) s vizuálním posouzení výsledku testu. Během těchto testů se analýza provádí po dobu 10 až 30 minut; nevyžadují speciální vybavení, vyžadují vizuální vyhodnocení výsledků, což je spojeno s určitou subjektivitou. Tyto metody mají přibližně stejnou senzitivitu a specificitu (70% a 90-93%) jako tradiční ELISA.

Použití metod imunitní analýzy má určitou hodnotu jako dodatečnou, zohledněnou v komplexu použitých metod, v diferenciální diagnostice tuberkulózy, zejména v diagnostice jejích extrapulmonárních forem. Nejúčinnější metoda ELISA je v diagnostice tuberkulózní meningitidy ve studii mozkomíšního moku. V tomto případě je citlivost analýzy 80-85% a specificita je 97-98%. Existují údaje o účinnosti detekce protilátek proti tuberkulóze mykobakterií v slzné tekutině při diagnostice tuberkulózní uveitidy.

Indukce syntézy gama interferonu in vitro

Gama interferon (IFN-γ) je specifický imunitní obranný faktor realizovaný aktivací makrofágových enzymových systémů. Indukce syntézy IFN-y senzibilizovanými T-lymfocyty způsobuje jejich interakci s antigeny mykobakterií.

Jako antigeny používané jako tuberkulin PPD. A specifické antigeny, získaná genetickým inženýrstvím, zejména antigeny ESAT-6 (časné sekretovaný antigen o molekulové hmotnosti 6 kDa) a CFP-10 (filtrát kultury protein 10 kDa). Genetické inženýrství nebo rekombinantní antigeny chybí v buňkách BCG vakcíny a jiných mykobakterií. Při použití tuberkulinu jsou výsledky indukčního testu IFN-γ srovnatelné s výsledky tuberkulinového kožního testu (přímá korelace). Při použití geneticky upravených antigenů jsou výsledky testů specifičtější a nezávisí na předchozím očkování BCG. Při testování očkovaných osob, které neměly kontakt s infekcí tuberkulózou, je specificita testu 99%. Citlivost testu u pacientů s tuberkulózou se pohybuje od 81 do 89%.

Testy a diagnostické nástroje byly vyvinuty na základě krátkodobou kultivaci buněk nebo mononukleárních buněk plné krve, izolovaných z krve s antigeny Mycobacterium tuberculosis in vitro s následným stanovením koncentrace IFN-y nebo spočítáním počtu T-lymfocytů, které syntetizují IFN-y v. Koncentrace interferonu syntetizovaného ve zkumavce byla stanovena metodou ELISA za použití monoklonálních protilátek vážících IFN-y. Poté kalibrací standardního IFN-γ se jeho koncentrace stanoví ve zkumavce nebo jamkách destičky.

Při provádění testu Elispot byl počet T-limocytů syntetizujících IFN-γ. Se počítá na povrchu destičky potažené protilátkami proti IFN-y.

Vývojáři Diagnosticum na IFN-γ in vitro prostřednictvím indukce, který je schválen agenturou pro léčiva a amerických produktů, tvrdí, že test je možné rozlišovat mezi latentní TBC z aktivní tuberkulózy. Proto v oblastech s vysokou mírou infekce není test přímo diagnostikovaný. V naší zemi se však může použít k odlišení infekce tuberkulózy u dětí po alergii po vakcinaci a k posouzení úrovně specifické imunity v procesu léčby.

V současné době se zkoumá domácí testovací systém pro stanovení indukce syntézy IFN-γ specifickými tuberkulózními antigeny in vitro.

Imunitní stav a průběh tuberkulózy, imunokorekce

V procesu léčby tuberkulózy u lidí dochází ke změnám v antigeneze a stavu imunitního systému.

Údaje o změnách v exsudátech a tkáních jsou do značné míry protichůdné. Jediné, co lze s dobrým důvodem poznat, je to, že u tuberkulárních granulomů je zpravidla zjištěn značný počet aktivovaných T-lymfocytů.

Má smysl zabývat se dvěma dalšími ustanoveními, která jsou nezbytná k pochopení role imunologických mechanismů při léčbě tuberkulózy u lidí:

• Pacienti s AIDS mají obzvláště vysoký výskyt rezistence na více léčiv;
• s vícenásobnou rezistencí na léčiva (a v nepřítomnosti infekce HIV) jsou obzvláště významné poruchy imunity (zvláště spojení T-buněk).

Když tuberkulóza široce aplikovat různé metody imunomodulaci: se jedná zejména o léky působící především na imunity T-buněk a systém mononukleárních fagocytů (brzlíku hormony, isoforon, likopid, polioksidony et al.). Stejně jako celé (zeslabené) mykobakterie a jejich složky.

Molekulárně-biologická diagnostika tuberkulózy

Pro metody molekulární biologie v diagnostice infekčních onemocnění zahrnují, zejména, metody založené na manipulaci s genetický materiál bakteriálních a virových patogenů k identifikaci specifického genetického materiálu - DNA segmenty, které mají nukleotidovou sekvenci, specifickou pro konkrétní kmeny typu nebo patogen k analýze specifických Sekvence DNA v genech, které určují citlivost patogenu na určité léčivé látky a také funkční analýzu aktivitu určitých genů patogenu. Molekulárně biologické techniky byly široce ve vědeckém výzkumu a praktické aplikace v diagnostice a monitorování různých bakteriálních a virových infekcí po otevření v roce 1985, Carrie Myullisom (vítěz Nobelova cena. 1989) polymerázovou řetězovou reakcí.

Principy a možnosti metody polymerázové řetězové reakce

PCR umožňuje amplifikovat (množit) in vitro nukleotidovou sekvenci (DNA fragment patogenu) několik hodin v milionech časů. Reakce v přítomnosti jednotlivých DNA řetězců určuje mimořádně vysokou citlivost testu.

Nukleotidová sekvence určitých oblastí v řetězci DNA určuje genetickou identitu mikroorganismu, což vysvětluje vysokou specifitu PCR.

Hodnota této techniky pro detekci a vyšetřování vlastností způsobené Mycobacterium tuberculosis biologické vlastnosti mikroorganismu, které mají velmi pomalý růst: čas Mycobacterium tuberculosis DNA zdvojení při kultivaci je 12-24 hodin.

Princip metody PCR spočívá v zesílení - vícenásobné, miliony časy. Vynásobení úseků specifické sekvence DNA v mikrovolněch trubek během cyklické recidivy následujících tří reakčních stupňů, z nichž každá prochází v jiném teplotním režimu:

• Stupeň I - denaturace dvouřetězcové DNA při zahřívání s divergencí řetězců;
• II stupeň - komplementární vazba (hybridizace) primerů (primární oligonukleotidy) s terminálními úseky řetězců přísně specifických, zvolených pro násobení DNA fragmentu;
• Stupeň III - dokončení řetězce DNA fragmentu pomocí termostabilní DNA polymerázy.

Pro amplifikaci in vitro musí existovat molekuly matricové DNA. čtyři druhy deoxynukleosidtrifosfátů (nukleotidů) obsahujících vhodná dusíkatých bází: adenin (A), thymin (T), guanin (G), cytosin (C); uměle syntetizované primerové oligonukleotidy (primery) tvořené 18 až 20 bazovými páry; termostabilní DNA polymeráza, která má teplotní optimum 68-72 ^na C, a hořečnatých iontů.

Specificita PCR závisí na volbě fragmentu DNA. V souladu s tím se syntetizují oligonukleotidy z boku osiva. Specificita hybridizace a dokončení řetězce DNA je způsobena principem komplementarity následujících párů dusíkatých bází: adenin-thymin, guanin-cytosin.

Pro stanovení genomové tuberkulózní mykobakterie komplex nejúčinnější cíl amplifikace ve většině testovacích systémů vybraných fragmentů DNA IS6110, která ve většině kmenů Mycobacterium tuberculosis genomu má významné množství (10-20) opakování, která poskytuje, společně se specificitou, vysoké citlivosti testu. Ve stejné době, kmeny Mycobacterium tuberculosis je popsáno s malým počtem opakování nebo žádnou IS6110 fragmentu.

Izolace molekul DNA z biologického vzorku

Pro provedení PCR by molekuly DNA patogenu měly být izolovány z biologického materiálu v minimálním objemu s minimálním množstvím nespecifické DNA a různých inhibitorů enzym-DNA polymerázy.

Příprava vzorků by měla být prováděna za podmínek, které brání křížové kontaminaci vzorků izolovanými molekulami DNA. Za tímto účelem je potřeba ošetření místnosti ultrafialovým povrchem, podlahami a pracovními plochami stolů a spotřebičů s roztoky obsahujícími chlor. Také povinné použití čistých rukavic, jednorázových zkumavek a špiček na automatické pipety.

Pro izolaci DNA Mycobacterium tuberculosis z klinických vzorků (mozkomíšní mok, bronchiální mytí) neobsahující velké množství buněk, buněčný odpad, nebo jejich solí, je dostatečné k centrifugovat vzorek 3-4 tis. Otáček za minutu, přidá se do kalu 20-30 ul 2% roztoku triton X-100 a zahřívána při 90 ° C ^o C po dobu 30 minut.

Pro přípravu vzorků sputa musí být efektivní zkapalňování, který se obecně používá pro 4% roztoku hydroxidu sodného a N-acetyl-L-cystein (NALC), v množství 50-80 mg na vzorek - v závislosti na viskozitě vzorku. Roztok NALC se musí připravit ex tempore nebo prášek NALC lze přidat do vzorku přímo. Po zkapalnění se vzorky centrifugují po dobu 15 minut při rychlostech 3,5 až 4 000 ot / min (3000 g) v 50 ml lahvičkách se šroubovými uzávěry, tj. Za stejných podmínek, které se doporučují pro předběžnou přípravu hlenu.

Pro extrakci DNA z metody pelet se použil nejčastěji založeny na použití 5-6 M roztoku guanidin isothiokyanátu lyzační roztok, jako mikroporézních částic a oxidu křemičitého ( „křemeliny“) sorbovat molekuly DNA. Nespecifické látek, včetně inhibitorů možné, potom se promyje do 2,5 molárního roztoku guanidinium isothiokyanátu a roztokem ethanolu, načež se molekula DNA desorbované vody, a tyto vzorky byly použity k provedení PCR. Pro zjednodušení technologie extrakce DNA se "křemelina" často nahrazuje magnetickými mikročásticemi pokrytými oxidem křemičitým. V tomto případě se použije speciální magnetický stojan pro mikrotubuly místo odstředění, aby se vysrážely částice.

V Rusku se vyvinula originální metoda pro imunomagnetické oddělení mykobakterií a následnou extrakcí DNA patogenu. Pro Mycobacterium tuberculosis imunomagnetické separaci pomocí ferroparticles velikosti 3-5 um, potažené oxidem křemičitým, s nimiž jsou spojena pomocí chemických vazeb polyklonální (králík) protilátky proti Mycobacterium tuberculosis. Vzorky sputa po alkalické lýze jsou neutralizovány kyselým roztokem tris-HCl a inkubovány s imunomagnetickým sorbentem. Poté jsou imunoferonové částice shromažďovány magnetickou tyčí s vyměnitelným hrotem, převedeny na mikrotubu a vysráženy. Přidá se 20-30 ul 2% roztoku Triton X-100 a 30 minut se zahřeje na 90 ^° C. Supernatant se používá jako DNA templát pro PCR analýzu.

Složitým problémem je izolace DNA mycobacterium tuberculosis z biopsických vzorků. Pro enzymatickou biopsii se enzymová proteinasa K použije při konečné koncentraci 200-500 mg / l při teplotě 56 ^° C přes noc. Dále je použita jedna ze známých metod. Nadbytečná nešpecifická DNA v PCR analýze biopsií často způsobuje inhibici reakce, která vyžaduje opakovanou extrakci DNA.

Metody detekce výsledků

Po dokončení reakce se amplifikované fragmenty DNA patogenu identifikují různými metodami.

Metoda gelové elektroforézy je dobře známa. Výsledný fragment DNA je identifikován pozitivní kontrolou obsahující požadovaný specifický fragment DNA nebo podle známého rozměru (počet párů nukleotidů) fragmentu, který se stanoví za použití standardního molekulárního markeru.

V přítomnosti specifického barviva je ethidiumbromid zahrnut v dvojvláknové DNA. Syntetizovaný fragment DNA je detekován jako pás světelný pod působením ultrafialového záření.

Velikost DNA fragmentu, stanovená elektroforézou ze vzdálenosti od počátku, musí odpovídat známému markeru molekulové hmotnosti nebo pozitivní kontrole.

Další způsoby určování výsledků PCR založené na hybridizaci s jediným řetězcem produkty PCR s oligonukleotidem, komplementární k ní - DNA sondy značené biotinem, následnou detekcí pomocí enzymatických reakcí, například vazbou na streptavidin-biotin alkalickou fosfatázou.

Na základě tohoto typu detekce byly vytvořeny analyzátory PCR, ve kterých se detekce výsledků PCR provádí automaticky jako výsledek odečtení optické hustoty ve vzorcích po projevu enzymatické reakce.

Nevýhodou těchto metod jsou možnosti intralaboratorní kontaminace poměrně krátkými fragmenty DNA molekul. Když molekuly vstupují do nových vzorků, stávají se matricí pro PCR a vedou k falešně pozitivním výsledkům.

V tomto ohledu je třeba zabránit falešně pozitivním výsledkům: zavedení přísných pravidel pro separaci a izolaci prostorů: extrahování DNA z biologických vzorků; prostory pro zjištění výsledků (elektroforézy) z čisté zóny. Tyto prostory jsou oblastí s pravděpodobnou kontaminací. Další izolovaná oblast je čistá místnost pro zavedení vzorků DNA, které mají být testovány v zkumavkách s reakční směsí pro PCR. Konečně se předpokládá, že hlavní zařízení - zesilovač DNA - by mělo být umístěno v samostatné, případně kancelářské místnosti.

Aby se zabránilo kontaminaci produktů předcházejících reakcí - některé testovací systém Likon-amp PCR namísto dezoksinukleozidtimidina obsahují dezoksinukleoziduridin, které, pokud jsou součástí in vitro syntéza obvodu namísto ve správné poloze, to znamená, Dusíková báze tyminu přítomná v nativní DNA je nahrazena uracilem. Uracil DNA glykosylázy se přidá do reakční směsi na analyt, zničí pouze kontaminující fragmenty deoxyuridin, ale ne nativní DNA analyzována. . Následné zahřívání při 94 ^° C inaktivuje tento enzym a neinterferuje s amplifikací v PCR.

Existuje testovací systém založený na izotermické amplifikaci rRNA, pro který se nejprve provádí reverzní transkripce a syntéza molekul DNA. Který je zase matrice pro následnou syntézu molekul RNA. RNA amplicony jsou detekovány za použití sondy DNA zachycené akridinem, když jsou hybridizovány v roztoku reakční zkumavky. Tato metoda má kromě vysoké citlivosti výhodu analýzy v jedné trubce, která zabraňuje kontaminaci. Podle autora citlivost této metody v respiračních vzorcích dosahuje 90% se specificitou 99-100%.

Nové metody detekce jsou implementovány v PCR v reálném čase. Tyto metody se liší primárně v tom, že PCR a detekce jeho výsledků se provádí současně v jedné uzavřené trubici. To nejen technologicky zjednodušuje techniku analýzy, ale také zabraňuje kontaminaci laboratorních místností a testovaných vzorků s produkty předchozích PCR.

V reálném čase výsledků detekce PCR je v důsledku fluorescence vznikající při fluorogenní DNA hybridizace sondy s amplifitsi Rui-PCR v průběhu specifických fragmentů DNA. Struktura fluorogenní sondy DNA konstruovány tak, že fluorescenční marker je vydána jako výsledek enzymatické reakce nebo vzdálen od molekuly zhášeče fluorescence pouze za specifické hybridizace s požadovanou molekulou DNA, který má být amplifikován v průběhu PCR. Jak se počet molekul sondy hybridizovaly s zvýšení fluorescence je úměrná zjištěné úrovně počtu molekul amplifikovaného produktu. Vzhledem k tomu, při každém počtu cyklů PCR fragment molekuly DNA se násobí o polovinu, číslo cyklu, při které se fluorescence stanovená a zvyšuje nepřímo úměrný počtu molekul DNA v počátečním vzorku. V případě, že reakce je představit jako kalibrátoru několik různých známých koncentrací molekul odpovídajících DNA fragment Mycobacterium tuberculosis, použitím počítačového programu může být vypočítána a množství genomové DNA v testovaném materiálu.

Každý standardní vzorek je duplikován. Kvantitativním kritériem je minimální počet PCR cyklů nezbytných pro nástup a růst stanovené fluorescence. Na úsečce - počet cyklů; osa je fluorescenční hodnota. Koncentrace DNA jsou nepřímo úměrné počtu cyklů potřebných pro vzhled fluorescence. V pravém sloupci (21-32) jsou vyznačena čísla cyklů odpovídajících koncentrací. Rozdíly mezi 10-násobnými koncentracemi fragmentů DNA 10 ² -10 ⁶ ml - 3,2 až 3,4 cykly. Pro dva pacienty byly koncentrace fragmentů IS6110 asi 10 ³ / ml a 10 ⁴ / ml. Vzhledem k počtu opakování (6-20) fragmentů analyzovaných v genomu Mycobacterium tuberculosis je počet mykobakterií v klinických vzorcích přibližně 100 a 1000 buněk.

Použití PCR při diagnostice tuberkulózy

Metoda PCR se nejčastěji používá k urychlené diagnostice tuberkulózy - detekce mykobakterie tuberculosis v klinických vzorcích: sputa. Bronchiální zavlažování, pleurální exsudát, moč, cerebrospinální tekutina, bodkovaná osteolýza, aspirace ženských genitálních traktů a různé vzorky biopsie. Ve studii v Nizozemí byly studovány asi 500 sputu a bronchiální laváže vzorků od 340 pacientů s potvrzenou diagnózou plicní tuberkulózy porovnat citlivost metody PCR, mikroskopie a studie kultura nátěrech. Citlivost analýzy byla 92,6,88,9 a 52,4%. Specificita všech metod byla asi 99%.

Byl srovnáván účinnost detekce mycobacterium tuberculosis mikroskopií smearů, naočkování na mediu Levenstein-Jensen, testovací systém VASTES a PCR analýza. PCR ukázala citlivost 74,4%, mikroskopie - 33,8%, osivo na hustém médiu - 48,9% a VASTES - 55,8%. Průměrná doba detekce pro naočkování na mediu Levenstein-Jensen je 24 dní. VASTES - 13 dní, PCR - 1 den.

Jsou také diskutovány možnosti použití PCR jako citlivé a rychlé metody monitorování účinnosti léčby tuberkulózy.

Detekce Mycobacterium tuberculosis DNA pomocí PCR s účinné chemoterapie určí po delší dobu - v průměru 1,7 měsíce ve srovnání s stěru definovaným pod fluorescenčním mikroskopem, a od 2,5 měsíce ve srovnání s bakteriologického vyšetření.

Diagnóza extrapulmonárních forem tuberkulózy

Hodnota jako citlivou metodou PCR je obzvláště velký pro mimoplicní formy, neboť tvoří v těchto klinických a radiografických metod obvyklých bakteriologickými metodami pro stanovení Mycobacterium tuberculosis v diagnostických materiálů neúčinné.

Při zkoumání vzorků moči PCR výsledky byly pozitivní v 16 z 17 pacientů s aktivní tuberkulózou a negativní močového 4 pacientů neaktivní ledvin tuberkulózy a 39 pacientů s močovou nontubercular onemocnění systém.

Účinnost PCR analýzy ve studii o aspiracích kostní dřeně u pacientů s horečkou neznámého původu byla prokázána v případech podezření na tuberkulózu. Pro diagnostiku tuberkulózní lymfadenitidy bylo u dětí vyšetřeno 102 odsávacích dýchacích cest a vzorku biopsie 67 dětí s podezřením na tuberkulózní lymfadenitidu. Byly získány pozitivní výsledky: 71,6% PCR v reálném čase. Fluorescenční mikroskopie - 46,3%. Kulturní výzkum - 41,8%. Ve studii s 50 biopsiemi lymfatických uzlin u pacientů s "škrábnutím" byly všechny výsledky negativní. Byla tedy prokázána 100% specificita PCR analýzy. Ve stejné práci, s punkční biopsií lymfatických uzlin, byla prokázána možnost detekce M. Avium.

Diagnostika tuberkulózy neplodnosti ženských genitálních oblastí, jak je známa, je jedním z nejtěžších problémů diagnostiky. Při zkoumání PCR biopsie endometria, endometriální aspiráty kapalných vzorků od Douglas prostoru 14 (56%) z 25 vyšetřených pacientů laparoskopicky podezření na tuberkulózu, byly získány pozitivní výsledky. Při použití mikroskopie a kultury byly získány výsledky 1 a 2. Tyto případy byly také pozitivní na PCR. Většina PCR-pozitivních výsledků se týkala případů s charakteristickými příznaky tuberkulózy podle histologické studie; menší počet - s podezřením na tuberkulózu podle údajů laparoskopie. Při absenci laparoskopických údajů pro tuberkulózu byl získán pouze jeden pozitivní výsledek analýzy PCR.

Při diagnostikování extrapulmonárních forem tuberkulózy mají klinici často otázku ohledně možnosti detekce patogenu při testování vzorků krve metodou PCR. Literární údaje naznačují, že detekce DNA z Mycobacterium tuberculosis z krevních vzorků je možná s dalekosáhlými formami infekce HIV. DNA mycobacterium tuberculosis byla detekována pouze s generalizovanou tuberkulózou různých orgánů u pacientů s transplantovanou ledvinou a imunosupresí.

[89], [90], [91], [92], [93], [94], [95]

Identifikace druhů mykobakterií

Metoda PCR může být velmi účinná pro rychlou identifikaci mykobakterií z tuberculosis a některých druhů mykobakterií nontubercular po obdržení jejich počáteční růst. V tomto případě může použití PCR ušetřit 7-10 dní, které jsou nezbytné pro následnou kulturní identifikaci pozitivního výsledku. Test PCR je technicky velmi jednoduchý, protože nevyžaduje komplikovanou přípravu vzorku klinického materiálu pro dosažení vysoké citlivosti. Ve studii 80 pozitivní v tomto testovacím systému (firmy MB Vasto. Organon) všechny pozitivní kultury PCR byly přísně specifické a udržuje po dobu 1 dne. Pro identifikaci jiných druhů mykobakterií v přípravě DNA patogena kultury hybridizované se specifickými DNA sondami značenými akridin a kmeny zjištěných vzhledu chemiluminiscence prostřednictvím chemiluminometru nebo nitrocelulózové proužky s vizuálním hodnocením po hybridizaci. S pomocí takové sady je identifikován omezený počet druhů: komplex mycobacterium tuberculosis. M. Avium, M. Avium komplex, M. Kansasii a M. Gordonae.

A.Telenti a kol. Také vyvinul relativně jednoduchý a levný způsob identifikace druhů klinicky významných druhů mykobakterií pomocí PCR a následnou reakcí se dvěma restrikčními enzymy (enzymy, které mají schopnost snížit molekulu DNA na specifických místech). Fragment DNA se zesiluje. (65 kDa) a fragment PCR z 439 párů nukleotidů produkovaný pomocí PCR se zpracovává odděleně dvěma enzymy: Bste II a Nae III. Pak analyzovány pomocí elektroforézy v agarosovém gelu získány dva produkty, určení jejich velikosti (počet párů bází) pomocí standardní soubor fragmentů DNA (molekulová DNA markery) v délce od 100 do 1000 párů bází. V každém z těchto specifických typů (M. Tuberculosis, M. Avium, M. Intracellulare, M. Kansasii, M.fortuitum) detekovat dva nebo tři DNA fragmenty různé velikosti pro každý restrikční enzym. Kombinace různých velikostí DNA umožňuje rozlišovat tyto druhy mezi sebou.

Technologie biologických DNA mikroskopů se vyvíjí. Což pomůže identifikovat více než 100 druhů mykobakterií v jedné studii.

Identifikace druhů se může také provádět pomocí PCR amplifikaci variabilní oblasti 16S rRNA následuje sekvenování amplikonů při srovnání s odpovídající primární struktuře, která umožňuje identifikaci více než 40 druhů mykobakterií.

Pomocí PCR lze také provést identifikaci druhu v komplexu mycobacterium tuberculosis včetně diferenciace M. Bovis a M. Bovis BCG. K tomu dochází k analýze přítomnosti nebo nepřítomnosti některých genů v genomických oblastech RD1. RD9 a RD10. RD1 chybí v M. Bovis BCG, ale je přítomen v virulentních druzích, včetně M. Bovis.

Stanovení citlivosti přípravku Mycobacterium tuberculosis na léky metodou PCR

Cíle molekulárně genetických metod pro lékové vnímavostí nebo odolností Mycobacterium tuberculosis snížit k identifikaci mutací ve specifických nukleotidových sekvencí známých genů. Základní metody jsou založeny buď na přímém prochityvanii (sekvenování) těchto sekvencí po amplifikaci a hybridizaci DNA fragmentů biotinem značené amplifikované v PCR sond DNA. Obě alternativy zahrnují identifikaci substituce nukleotidů v sekvencích, které používají sondy DNA vedou k nepřítomnosti nebo neúplné hybridizaci na nitrocelulózovou membránu s použitím enzymového konjugátu (streptavidin-alkalická fosfatáza) - Metoda Lípa-Rif-TB.

Metoda pro měření fluorescence v místně upevněn na mikrovýbrusů DNA sondami komplementárními se známými mutacemi v PCR amplifikovaných oblastí genu odpovědné za rezistenci nebo citlivosti na léky, tzv mikrobiochipov metoda. Hlavní algoritmus pro provádění tohoto výzkumu je následující. Po izolaci DNA z klinického vzorku nebo kultury mykobakterií je nutné provést PCR amplifikaci příslušných fragmentů rpoB genu odpovědného za citlivosti na léky na rifampicin nebo katG a inhA genů kódujících proteiny Mycobacterium jsou zodpovědné za citlivost na isoniazid. Výsledky PCR se vyhodnocují pomocí elektroforézy na agarosovém gelu, ve kterém se potvrdí odpovídající DNA fragmenty požadované délky. Pak se provede druhé kolo PCR, aby se do DNA vložila fluorescenční značka. Výsledky PCR jsou opět potvrzeny gelovou elektroforézou. Poté, hybridizace byla prováděna (inkubace přes noc), s následným promytím výsledného materiálu na biočip, který je velký počet pevných do malé skleněné desky krátkých řetězců DNA (sond), které jsou komplementární s nukleotidovou sekvencí typu Mycobacterium tuberculosis senzitivním v místech možných mutací. Stejně jako mutantních sekvencí zodpovědných za rezistenci vůči lékům. Umístění DNA sond na talíři - v pravém slova smyslu, a úroveň fluorescence pozorované při hybridizaci k určení výsledku pomocí speciálního čtecího zařízení je instalován. V tomto ohledu jsou výsledky analýzy určeny pomocí speciálního počítačového programu.

V posledních letech byly vyvinuty alternativní metody pro stanovení lékové citlivosti mykobakterií tuberkulózy na bázi technologie PCR v reálném čase, které umožňují provádět tyto studie v uzavřeném testu.

Na Obr. 13-13 představuje výsledek analýzy klinických kultur mycobacterium tuberculosis při stanovení rezistence k léčivému přípravku rifampicin pomocí PCR v reálném čase: 218 - kontrolní vzorek (citlivý na rifampicin); 93 - pozitivní kontrola mutace Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - pozitivní kontrola mutace Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - experimentální vzorky. Výsledek výpočtu kinetických křivek amplifikace na 4 kanálech: kanál 1: 393 - pozitivní kontrola pro mutaci Ser-Trp TCG-TGG; kanál 2: 4482 - pozitivní kontrola mutace Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - experimentální vzorky; kanál 4: kinetické křivky amplifikace všech vzorků účastnících se experimentu. Pozitivní kontrola amplifikační reakce. Závěry: Na základě výsledků analýzy byly zjištěny následující mutace určující rezistenci na rifampicin: ve vzorcích 162,163,172,295-Ser-Leu TCG-TTG. Stejný princip byl použit k určení lékové rezistence vůči isoniazidu pro geny katG a inhA, což určuje nejčastější mutace.

[96], [97], [98], [99], [100], [101], [102], [103], [104]

Identifikace kmene mycobacterium tuberculosis

Nejvíce důkladně studován způsob identifikace kmenů Mycobacterium tuberculosis je technika tzv polymorfismu délky restrikčních fragmentů (RFLP RFLP,., Nebo v anglickém znění), a který je založen na fragmentirovanin (omezení) z Mycobacterium tuberculosis DNA enzymem PvuII a fragmenty získané následnou hybridizaci s určitými specifickými sekvencemi na DNA jeho opakovaný prvek IS6110. Vnitrodruhová variabilita realizováno různými počty opakování IS6110 a jejich umístění na DNA. Jakož i různých vzdáleností mezi určitých místech restrikční útok enzymu (restrikční místa) a prvek IS6110. Tato technologie je velmi složitá a časově náročná. Po ošetření DNA extrahované z kultury Mycobacterium tuberculosis, gelová elektroforéza se provádí s restrikčním enzymem, a pak se přenese DNA fragmenty různé délky na nitrocelulózovou membránu, hybridizace byla prováděna s fragmenty IS6110 prvku a detekována pomocí enzymatické reakce. Specifické DNA proužky výsledný vzor charakterizuje konkrétní kmen Mycobacterium tuberculosis. Pomocí počítačové analýzy se zjistí identita nebo příbuznost kmenů. Navzdory skutečnosti, že metoda RFLP je nejvíce diskriminační, tj. Identifikuje největší počet rozdíly v analyzovaných kmenů, je neúčinné pro malé množství (méně než 5), IS6110-repetic pozorované u některých kmenů. Na Obr. 13-14 znázorňuje výsledky RFLP typování kmenů.

Alternativou může být metoda spolygotypizace - analýza polymorfismu distančních DNA sekvencí - mezilehlé mezi přímými opakováními oblasti DR. Při provádění homogenizace kmenů se provádí PCR s primery ohraničujícími DR oblast, po které se vytvoří fragmenty různé délky, které hybridizují s proměnnými intermediárními oblastmi DNA. Analýza distančních sekvencí oblasti DR je prezentována. Podle výzkumníků jednodušší, produktívnější a vhodnější pro primární screening kmenů a předběžnou epidemiologickou analýzu, stejně jako výzkum přímo klinického materiálu.

Je zřejmé, že efektivnější a technologicky dostupnější metoda je VNTR (zkratka anglických slov) nebo metoda určení variabilního počtu přesných tandemových opakování v DNA mycobacterium tuberculosis. Tato metoda je založena pouze na použití PCR a nevyžaduje další manipulaci. Jelikož počet tandemových opakování v různých kmenech a v různých místech se liší, stanoví se fragmenty různých velikostí a analyzují se na výsledné elektroforem PCR produktů. Podle vědců dosahuje používání VNTR větší stupeň rozlišování kmenů než metodou RFLP.

V posledních letech byla věnována značná pozornost distribuci kmenů Mycobacterium tuberculosis z rodiny W-Beijing (někdy nazývané kmen Peking), které jsou převážně odolné vůči drogám.

Základní požadavky na kvalitu molekulárně biologického výzkumu

[105], [106], [107], [108], [109], [110]

Základní regulační dokumenty pro PCR

Objednávky Ruské ministerstvo zdravotnictví: №45 od 02.07.2000 g .. číslo 109 z 21.03.2003 g .. číslo 64 z 21.02.2000, pokynů: 1.3.1888-04 „Organizace práce ve studiích s použitím PCR materiálu infikovány patogenním biologický činidla skupin III-IV patogenní "; 1.3.1794-03 "Organizace práce při studiu materiálu PCR infikovaného mikroorganismy patogenních skupin I-II". 2003; 3.5.5.1034-01 „Dekontaminace materiálu, infikované bakterie I-IV patogenity skupiny při použití PCR,“ 2001 dodatku 11 k jednotné pokyny pro mikrobiologické vyšetřovací metody v identifikaci, diagnostiku a léčbu tuberkulózy.

[111], [112], [113], [114]

Zaměstnanci

Provedení molekulárně biologickém výzkumu může držet doktory klinické laboratorní diagnostiky, lékaři bacteriologists, virologists, lékaři, biologové, klinické diagnostické laboratoře, stejně jako specialistů se středním vzdělávání lékařů, prošel specializaci a pokročilý výcvik v předepsaným způsobem.

Uspořádání laboratorních prostor

Vyžadují se následující laboratoře:

• Oblast manipulace s vzorkami je laboratoř přizpůsobená pro práci s infekčními agensy patogenních skupin III-IV podle metodických pokynů 13.1888-04.
• Zóna pro přípravu reakčních směsí PCR - laboratorní místnost, která zajišťuje ochranu před interním laboratorním znečištěním - "čistou" zónou.
• • Pokud se k analýze produktů PCR používá elektroforéza nebo hybridizace. Laboratoř místnost, ve které jsou vynásobený fragmenty DNA se extrahuje z trubek a zesílení, v tomto pořadí, se může dostat do životního prostředí, v souladu s požadavky na PCR laboratoře (1.3.1794-03 pokyny, vedení 1.3.1888-04) musí být plně je izolován od prostor uvedených v předchozích odstavcích. Mělo by být vyloučeny z pohybu zóny k zónové elektroforézy pro zacházení se vzorkem a „čistou“ oblasti jakéhokoli personálu, zařízení, použitých materiálů a předmětů, stejně jako přenos vzduchu ventilačním systémem, nebo v důsledku průvanu. Tato oblast není požadována pro fluorimetrickou detekci produktů PCR.
• Prostor pro dokumentaci a zpracování výsledků je vybaven počítačem a potřebným kancelářským vybavením. Tato místnost může obsahovat vybavení, které umožňuje detekci produktů PCR bez otevření trubice. - fluorescenční detektory PCR a tepelné cykly pro PCR v reálném čase.

Hygienické a epidemiologické požadavky na primární ošetření sputa jsou podobné standardním mikrobiologickým požadavkům na léčbu tuberkulózy mykobakterií.

[115], [116], [117], [118], [119]

Dokončení laboratorního vybavení pro diagnostiku PCR

Laboratoř obsahuje vybavení pro následující místnosti.

• prostor pro přípravu vzorků, obsahuje následující vybavení: laminární kryt třídy II "SP-1.2": pevný termostat s topným krytem pro zkušební trubky typu "Eppendorf"; mikrocentrifuga při 13 000 ot / min; odstředivka (Vortex); Lednice s teplotním rozsahu od -20 ^až C 10 až ^asi C; pipety s proměnným objemem řady "Rroline"; čerpadlo s odlučovačem OM-1; stativ pro pipety; stativová pracovní stanice 200x0,5 ml; stativová pracovní stanice 50 x 1,5 ml; Stojany pro ukládání zkumavek 80x1,5 ml;
• Přípravná místnost pro reakční směs: ochranná komora PCR-box ("Laminar-C, 110 cm); odstředivka - Vortex; Pipety s proměnným objemem řady Proline; stativ pro pipety; stativová pracovní stanice 200x0,2 ml; Stojany pro ukládání zkumavek 80x1,5 ml; Lednice s teplotním rozmezí od -20 ^do C do + 10 ^o C;
• prostor pro elektroforézu: kamera pro horizontální elektroforézu; napájení; transilluminator;
• DNA zesilovače nebo analyzátory nukleových kyselin (PCR v reálném čase) s počítačem a softwarem; mohou být umístěny v libovolné volné místnosti. Pokud se používá technologie PCR v reálném čase. Prostor pro elektroforézu není potřeba.

[120], [121], [122], [123], [124]

Externí kontrola kvality

Aby byli věří v získání objektivně spolehlivých výsledků, měly by se laboratoře účastnit systému externího hodnocení kvality laboratorního výzkumu.

Účastníci systému kontroly kvality obdrží; 12 lahviček lyofilizovaných bakteriálních buněčných suspenzí, z nichž dvě obsahují E. Coli E. Kokosové vlákno, 3 lahvičky s Mycobacterium tuberculosis (avirulentní kmen) v 10 ² / ml; 3 ampule s buňkami podobného kmene v koncentraci ¹⁰⁴ / ml; 2 ampule nontubercular Mycobacterium avium-intracellulare M. A M. Kansasii v koncentraci 10 ⁵ / ml.

Distribuované testy pro externí hodnocení kvality jsou předběžně testovány ve dvou nezávislých laboratořích s rozsáhlými zkušenostmi v této oblasti.

[125], [126], [127], [128]